Biologia molekularna roślin.pdf

Zakład Biologii Molekularnej Roślin

Uniwersytet Warszawski

Instytut Biochemii i Bioﬁ zyki PAN

B IOLOGIA M OLEKULARNA R OŚLIN

Skrypt do ćwiczeń

Warszawa, 2006

Spis Treści

1. Analiza zmian na poziomie chromatyny w cyklu komórkowym ...........................3

Izolacja białek z materiału roślinnego ...........................................................................................4

Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS ............................................5

Przygotowanie żelu do SDS PAGE...........................................................................................6

Elektroforeza ............................................................................................................................7

Barwienie białek w żelu ........................................................................................................... 7

Western blot .....................................................................................................................................8

Detekcja .................................................................................................................................... 9

2. Analiza mutantów RNAi w genach kodujących warianty histonu H1 . ..............10

RT-PCR ...........................................................................................................................................10

Matrycowy RNA ......................................................................................................................... 10

Odwrotna transkrypcja ................................................................................................................ 11

Półilościowy RT-PCR ................................................................................................................. 11

Izolacja całkowitego RNA .............................................................................................................11

Synteza jednoniciowego cDNA .....................................................................................................12

Półilościowy multiplex PCR ..........................................................................................................13

Przygotowanie żelu agarozowego ............................................................................................... 13

3. Badanie oddziaływań białek - drożdżowy system dwuhybrydowy .....................14

AtSWI3B ........................................................................................................................................14

FCA .................................................................................................................................................14

Schemat doświadczenia .................................................................................................................15

Transformacja drożdży .................................................................................................................15

Przygotowanie do wykonania testu dwuhybrydowego ..............................................................16

Test dwuhybrydowy ......................................................................................................................16

Zasady prowadzenia zeszytu laboratoryjnego .........................................................18

Literatura .....................................................................................................................18

UWAGI:

Zeszyt laboratoryjny jest podstawą do zaliczenia ćwiczeń. Wskazówki dotyczące

prowadzenia zeszytu laboratoryjnego znajdują się na stronie 18 skryptu.



Akrylamid i bisakrylamid są silnymi neurotoksynami wchłanianymi przez skórę.

W trakcie ważenia należy wkładać fartuchy, rękawiczki, maski i okulary. Pomimo

że poliakrylamid jest uważany za nietoksyczny zawsze należy zakładać rękawiczki

- może bowiem zawierać resztki niespolimeryzowanego akrylamidu.



2-merkaptoetanol i DTT – są szkodliwe dla błon śluzowych, górnych dróg

oddechowych, skóry i oczu. Powinny być używane tylko pod wyciągiem,

w rękawiczkach.



APS i TEMED są szkodliwe dla błon śluzowych, górnych dróg oddechowych, skóry

i oczu. Wdychanie oparów, jak i kontakt ze skórą może prowadzić do poważnych

schorzeń.



SDS – odważanie sypkiego odczynnika tylko w maseczce.

TCA – silny kwas, pracować w rękawiczkach i fartuchu

PMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride) – jest substancją toksyczną (inhibitor

esterazy acetylocholinowej)



Fenol - substancja bardzo toksyczna, powoduje trudno gojące się oparzenia skóry,

jest rakotwórczy.



X-gal jest substancją silnie trującą.

W trakcie pracy z ciekłym azotem należy uważać aby nie ulec poparzeniu. Pracować

w fartuchu i suchych rękawiczkach. Podczas ucierania należy trzymać moździerz

przez bibułę lub rękawice kuchenną. Nie wdychać intensywnie.

 Roztwory tak oznaczone należy przygotować samemu.

 Substancja niebezpieczna.

A nAlizA z miAn nA P oziomie C hromAtyny w C yklu k omórkowym

1. Analiza zmian na poziomie chromatyny

w cyklu komórkowym

z jednej strony wpływać na oddziaływania DNA–

histony, decydując o lokalnym (lub jak w przypadku

mitozy – globalnym) rozluźnieniu lub kondensacji

chromatyny, co wpływa np. na możliwość wiązania

czynników transkrypcyjnych do znajdujących się

w tych obszarach promotorów. Z drugiej strony,

naznaczone modyikacjami epitopy histonów

mogą stanowić platformy rozpoznawane przez

różne białka regulatorowe. Niektóre modyikacje

histonów mogą brać udział w wielu, często różnych,

procesach. Np. fosforylacja seryny 10 histonu H3

bierze udział zarówno w kondensacji chromatyny

w czasie podziałów komórkowych, jak i w indukcji

genów wczesnej odpowiedzi pod wpływem różnych

czynników zewnętrznych - z czym wiąże się lokalne

rozluźnienie chromatyny.

Długość DNA w jądrze komórkowym jest

daleko większa niż rozmiar kompartmentu,

w którym się znajduje. Stąd też materiał genetyczny

musi występować w zorganizowanej i upakowanej

postaci, przy jednoczesnym zachowaniu możliwości

zachodzenia wielu ważnych procesów.

W przeciwieństwie do organizmów

prokariotycznych, DNA u eukaryota nie jest

„nagie”, ale występuje w postaci kompleksu

z białkami chromatynowymi, określającego

organizację strukturalną DNA w przestrzeni.

Dynamika tego kompleksu warunkuje zachodzenie

tak ważnych procesów, jak kondensacja

chromosomów, czy regulacja transkrypcji genów.

Podstawową jednostkę strukturalną chromatyny

stanowi nukleosom, będący kompleksem DNA

i pięciu zasadowych białek histonowych. W skład

pojedynczego nukleosomu wchodzi dyskowatego

kształtu oktamer histonów (tzw. rdzeń) H2A, H2B,

H3, H4, fragment cząsteczki DNA nawiniętej na

rdzeń nukleosomu, oraz stabilizujący oddziaływania

rdzeń – DNA histon łącznikowy H1. Za wiązanie

histonów w oktamerze, jak też za tworzenie miejsc

dla wiązania DNA, odpowiedzialne są domeny

Zależna od cyklu komórkowego fosforylacja

histonu H3 w serynie 10 jest konserwowana wśród

organizmów eukariotycznych. Ta dynamiczna

potranslacyjna modyikacja jest zaangażowana

zarówno w aktywację transkrypcji jak i w kondensację

oraz segregację chromosomów.

Mitoza jest jednym z ważniejszych etapów cyklu

komórkowego, kiedy to nowo zreplikowane nici

DNA są segregowane do dwóch biegunów dzielącej

się komórki, która następnie dzieli się na dwie

komórki potomne. Wiele procesów zachodzących

w trakcie mitozy jest uzależnionych od upakowania

chromatyny do jej mitotycznej formy. Pojawia

się coraz więcej dowodów na to, że upakowanie

chromosomów jest regulowane w dużej mierze

poprzez potranslacyjną modyikację histonów –

fosforylację. Obecnie fosforylacja histonu H3 jest

uznawana za jeden z mitotycznych biomarkerów.

Z obserwacji wielu organizmów wynika,

że poziom fosforylacji histonu H3 jest niski

w czasie interfazy, wzrasta na początku

podziałów komórkowych i opada podczas

telofazy. W przypadku komórek zwierzęcych

mitotycznie specyiczna fosforylacja S10 histonu

H3 rozpoczyna się w późnej fazie G2 w obszarach

perycentromerycznych heterochromatyny

i rozprzestrzenia się w sposób uporządkowany .

i zbieżny z kondensacją chromosomów. Modyikacja

ta jest jednolicie dystrybuowana na chromosomy

zarówno w mitozie jak mejozie.

U roślin natomiast, w trakcie podziałów

mitotycznych poziom fosforylacji jest wysoki

w częściach perycentromerycznych i niski

w obszarach ramion chromosomów. Ta specyiczna

dla perycentromerów fosforylacja może być

zaburzona przez działanie stresu chłodu lub

Rys.1. Schemat budowy nukleosomu z widocznymi

„ogonami histonowymi na zewnątrz rdzenia.

globularne histonów rdzeniowych o regularnie

rozmieszczonych ładunkach. N i C końce (tzn.

„ogony histonowe”) natomiast, mogą ulegać wielu

odwracalnym modyikacjom posttranslacyjnym

(Rys.1). W 2000 roku wysunięto hipotezę „kodu

histonowego”, która sugeruje, że istnieją pewne

określone wzory modyikacji histonów rdzeniowych

odpowiedzialne za zachodzenie konkretnych

procesów w komórce. Modyikacje te mogą bowiem

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: