polimorfizm STR niekodującego regionu ludzkiego GH.pdf

ARCH. MED. SĄD. KRYM., 2006, LVI, 95-98 PRACE ORYGINALNE

Magdalena Spólnicka a , Magdalena Konarzewska a , Ireneusz Sołtyszewski a , Jarosław Berent b

Polimorfizm STR niekodującego regionu genu ludzkiego hormonu

wzrostu (HUMGHCSA) i jego wykorzystanie w identyfikacji

osobniczej – doniesienie wstępne 1

STR polymorphism of the non-coding human growth hormone gene

(HUMGHCSA) and its use in personal identification – a preliminary report

Z Wydziału Biologii Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego Komendy Głównej Policji a

Naczelnik: dr n. med. Ireneusz Sołtyszewski i z zakładu Orzecznictwa Sądowo-Lekarskiego i Ubezpieczenio-

wego Katedry Medycyny Sądowej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi b

Kierownik: dr hab. n. med. Jarosław Berent, prof. nadzw.

Locus HUMGHCSA, zlokalizowane w obrębie niekodu-

jącego regionu genu ludzkiego hormonu wzrostu poło-

żonego na chromosomie 17, wykazujące polimorfizm ilo-

ści powtórek dwu- i czteronukleotydowych (CT i CTTT),

a także polimorfizm spowodowany podstawieniem nu-

kleotydu, jest jednym z najbardziej polimorficznych mar-

kerów typu STR. Celem niniejszej pracy było utworzenie

systemu fluorescencyjnej analizy dla automatycznego

sekwenatora, sprawdzenie jego wiarygodności i opraco-

wanie biostatystycznych parametrów przydatności w ba-

daniach kryminalistycznych dla tego układu. Badania

przeprowadzone na grupie 200 niespokrewnionych osób

wykazały obecność 24 różnych alleli o długości od 221

do 279 pz. Obliczenia biostatystyczne wykazały, że hete-

rozygotyczność oczekiwana wynosi 0,898634 +/-

0,015091, PD 0,980586, PIC 0,887709, PE 0,792767, PE

dla dwójek bez matki 0,656701 a średnia szansa ojco-

stwa 4,932625. Takie wyniki wskazują na dużą przydat-

ność badanego locus HUMGHCSA w badaniach identy-

fikacyjnych.

The purpose of this study was to report the creation of a

system of fluorescent analysis for an automatic sequencer,

the testing of its credibility and the elaboration of

biostatistical parameters of its usefulness in forensic

examinations of this system. The studies, carried out on

a group of 200 non-related persons, showed the presence

of 24 different alleles, of 221 to 279 bp in length.

Biostatistical calculations showed that expected

heterozygosity was 0,898634 +/- 0,015091, PD 0,980586,

PIC 0,887709, PE 0,792767, PE for motherless cases

0,6556701, and the average paternity index 4,932625.

Such results indicate great usefulness, for identification

examinations, of the HUMGHCSA locus studied.

Słowa kluczowe: STR, HUMGHCSA, dane popu-

lacyjne

Key words: STR, HUMGHCSA, population data

WSTĘP

The HUMGHCSA locus, located within the non-coding

region of the human growth hormone gene on

chromosome 17, exhibiting polymorphism of the number

of repeats of two and four nucleotide motifs (CT and

CTTT), but also polymorphism caused by nucleotide

substitution, is one of the most polymorphic STR markers.

Genotypowanie układów STR można przepro-

wadzić poprzez amplifikację DNA genomowego

z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy,

primerów specyficznych dla locus, rozdziału powie-

lonych fragmentów drogą elektroforezy i wizualiza-

Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach 2005-2006 jako projekt badawczy.

96 Nr 2

cji, np. za pomocą barwnika fluorescencyjnego.

Primery dla kilku loci STR można łączyć w jednej

reakcji multipleksowej, co pozwala na efektywniej-

sze genotypowanie i wykorzystanie mniejszej ilości

DNA, niż w przypadku, gdyby każde locus badane

było oddzielnie [1, 2]. Badanie DNA za pomocą ko-

mercyjnie dostępnych zestawów multipleksowych

pozwala na osiągnięcie bardzo dużej, i zazwyczaj

satysfakcjonującej, siły dyskryminacji w rutynowej

identyfikacji osobniczej. Jednak w niektórych przy-

padkach konieczne jest rozszerzenie badań o do-

datkowe wysokopolimorficzne markery STR. Do

takich markerów należą na przykład wykorzystywa-

ne już FGA, ACTBP 2, Penta D i Penta E. Jednak

nadal prowadzone są prace nad poszukiwaniem

i wdrażaniem nowych markerów, szczególnie tych

niesprzężonych z dotychczas używanymi. Takie

wysokopolimorficzne loci są użyteczne w identyfi-

kacji śladów biologicznych, w badaniach sporne-

go ojcostwa i identyfikacji nieznanych zwłok. Mogą

również znaleźć zastosowanie jako markery w scre-

eningach masowych, np. przy eliminacji osób nie-

związanych z przestępstwem.

Jednym z takich markerów jest locus HUMGHC-

SA, zlokalizowane w obrębie niekodującego regio-

nu genu ludzkiego hormonu wzrostu położonego

na chromosomie 17, wykazujące polimorfizm ilości

powtórek dwu- i czteronukleotydowych (CT i CTTT),

a także polimorfizm spowodowany podstawieniem

nukleotydu. Sekwencję primerów dla tego locus

opracował w 1998 roku zespół kierowany przez prof.

Andrzeja Płucienniczaka z Instytutu Biotechnologii

i Antybiotyków w Warszawie, który jednak nie opu-

blikował dalej wyników swych prac poza zgłosze-

niem patentowym [3, 4]. Na wykorzystanie sekwen-

cji primerów do obecnych badań uzyskaliśmy zgo-

dę prof. Andrzeja Płucienniczaka.

Primery te posiadają następującą sekwencję: 5’-

-GACAGAATGA GACTCCAACT G-3’ i 5’-CAGA-

ACAGGTAGTGTGGTGT -3’. Zakres drabiny allelicz-

nej wynosi od 221 do 279 par zasad. Polimorficzny

fragment znajduje się w miejscu oznaczonym

w Banku Genów HUMGHCSA 11027-11290.

MATERIAŁ I METODY

Materiałem do badań były wymazy z jamy ust-

nej pochodzące od 200 niespokrewnionych osób

różnej płci i wieku z różnych regionów Polski. Izola-

cję DNA genomowego przeprowadzono przy uży-

ciu zestawu firmy QIAGEN TM . Ilość DNA oznaczano

metodą hybrydyzacji z sondą D17S1 swoistą dla

DNA naczelnych (Quantiblot, PE, USA) z koloryme-

tryczną metodą detekcji lub pomiarem fluoryme-

trycznym. Następnie przeprowadzono optymaliza-

cję reakcji amplifikacji PCR, tj. stężenia starterów,

matrycowego DNA, Tag polimerazy, warunków ter-

micznych (temperatura hybrydyzacji, ilość cykli).

Reakcję PCR prowadzono w aparacie „GeneAmp

PCR System 9700” firmy Applied Biosystems

w objętości 25

l dNTPs

0,25 mM (Promega Co.), primer F/R 4 nM, 1 U Taq

DNA Polymerase (Promega Co.), 2,5-5 ng geno-

mowego DNA. Optymalny profil temperaturowy re-

akcji: denaturacja wstępna 94 stopnie C-2 min.,

następnie 32 cykle: 94 stopnie C – 30 sekund, 64

stopnie C – 30 sekund, 72 stopnie C – 30 sekund,

końcowe wydłużanie 72 stopnie C – 15 min. Do

amplifikacji wykorzystano startery o sekwencji:

F: 5’-FAM -GACAGAATGA GACTCCAACT G – 3’

R: 5’-CAGAACAGGTAGTGTGGTGT – 3’

Produkty reakcji PCR poddano elektroforezie

kapilarnej, w aparacie ABI PRISM 3100 Applied Bio-

systems. Produkty rozdzielano w kapilarze 3100,

36 cm wypełnionej denaturującym nośnikiem POP4.

Analizę otrzymanych wyników przeprowadzono

przy użyciu oprogramowania GeneScan 3.7. NT

wobec standardu wewnętrznego wielkości ILS 600

(Promega Co.).

Statystyczne opracowanie wyników przeprowa-

dzono przy użyciu programów komputerowych

GDA [5] i DLP [6], do których dane przygotowano

w formie pliku komputerowego w standardzie NE-

XUS [7]. Przy użyciu tych programów obliczono

heterozygotyczność obserwowaną i oczekiwaną

oraz jej błąd [8], siłę dyskryminacji [9], współczyn-

nik informacji o polimorfizmie [10], siłę wyklucze-

nia dla pełnych [11] i niepełnych trójek [12], jak

l MgCl 2 25 mM, 0,2

CEL PRACY

Celem pracy było utworzenie systemu fluore-

scencyjnej analizy dla automatycznego sekwena-

tora, sprawdzenie jego wiarygodności i opracowa-

nie biostatystycznych parametrów przydatności

w badaniach kryminalistycznych dla układu STR

w obrębie niekodującego regionu genu ludzkiego

hormonu wzrostu (HUMGHCSA).

Magdalena Spólnicka, Magdalena Konarzewska, Ireneusz Sołtyszewski, Jarosław Berent

l. Wydajność amplifikacji badano

przy zmiennym stężeniu matrycowego DNA wyno-

szącym odpowiednio 0,25 ng, 0,5 ng, 1 ng, 2 ng,

5 ng, 10 ng i 25 ng. Produkt reakcji uzyskano

w całym zastosowanym zakresie stężeń DNA, a ilość

produktu była wprost proporcjonalna do ilości ma-

trycy. Przy stężeniach 10 ng i 25 ng reakcja PCR

przebiegała ze zbyt dużą wydajnością i zaczęły po-

jawiać się niespecyficzne produkty reakcji. Optymal-

ne warunki amplifikacji ustalono jako: 1x PCR Bu-

for (Promega Co.), 1,5

Nr 2 97

POLIMORFIZM STR HORMONU WZROSTU

również minimalną i maksymalną [13] oraz średnią

szansę ojcostwa [14].

Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę

Komisji Bioetyki Uniwersytetu Medycznego w Ło-

dzi.

Tabela II. Parametry biostatystyczne określające stopień

polimorfizmu locus HUMGHCSA.

Table II. Biostatistical parameters determining the degree

of HUMGHCSA locus polymorphism.

WYNIKI I ICH OMÓWIENIE

HUMGHCSA

Ilość osób w populacji

200

Analiza 200 próbek DNA pochodzących od ko-

biet i mężczyzn z populacji polskiej wykazała obec-

ność 24 różnych alleli o wielkości od 221 do 279

pz. Rozkład częstości alleli był zgodny z rozkładem

częstości wyznaczonym w oparciu o prawo Hardy-

-Weinberga (p=0,567500).

Wielkości fragmentów DNA zaobserwowanych

w grupie badanej w locus HUMGHCSA oraz ich

częstości przedstawia Tabela I, a parametry biosta-

tystyczne określające stopień polimorfizmu tego

locus przedstawia Tabela II.

Ilość rodzajów alleli 24

Heterozygotyczność obserwowana 0,905000

Heterozygotyczność oczekiwana 0,898634

Błąd heterozygotyczności oczekiwanej 0,015091

Siła dyskryminacji (PD)

0,980586

Współczynnik informacji o polimorfizmie

(PIC) 0,887709

Siła wykluczenia dla pełnych trójek (PE) 0,792767

Siła wykluczenia dla dwójek bez matki 0,656701

Minimalna szansa ojcostwa

1,574803

Tabela I. Rozkład częstości alleli HUMGHCSA w popula-

cji polskiej.

Table I. Distribution of HUMGHCSA allele frequencies in

the Polish population.

Średnia szansa ojcostwa (TPI)

4,932625

Maksymalna szansa ojcostwa

400,000000

Allel

Ilość

Częstość

Locus HUMGHCSA charakteryzuje się bardzo

wysoką jak na loci STR liczbą alleli, co skutkuje

bardzo dobrymi wartościami parametrów biostaty-

stycznych określających stopień polimorfizmu,

w porównaniu do innych typowych loci STR [15,

16, 17]. Jedynie wyjątkowo spotyka się inne – bar-

dziej polimorficzne – loci STR, jak np. ACTBP2,

w którym opisano aż 41 różnych alleli [18].

Skonstruowanie i zoptymalizowanie systemu flu-

orescencyjnej analizy locus HUMGHCSA stwarza

możliwość wyodrębnienia nowego markera gene-

tycznego o bardzo dużej liczbie alleli (24) i wyso-

kiej wartości PD (0,980586).

W kolejnych etapach badań autorzy zamierzają

zsekwencjonować zidentyfikowane allele oraz za-

proponować ich nomenklaturę zgodną z ilością

powtórzeń opartą o wytyczne ISFG. Dla pełnego

zoptymalizowania locus HUMGHCSA skonstruowa-

na zostanie też drabina i przeprowadzona będzie

analiza większej populacji. Ponadto należy zauwa-

żyć, że na chromosomie 17 znajdują się też inne

markery genetyczne (D17S976, D178S26, D17S79,

D17S5), ale nie są one rutynowo wykorzystywane

w badaniach medyczno-sądowych. Jednak przed

włączeniem locus HUMGHCSA do zestawu multi-

pleksowego zawierającego markery z chromosomu

17 należało będzie też sprawdzić czy segregacja

ich jest niezależna. Będzie to przedmiotem dalszych

badań.

279

0,0050

275

0,0125

271

0,0050

269

0,0025

267

0,0075

261

0,0150

259

0,0025

257

0,0875

253

0,1225

251

0,0025

249

0,1800

247

0,0100

245

0,1375

243

0,0300

241

0,1350

239

0,0325

237

0,0725

235

0,0225

233

0,0425

231

0,0175

229

0,0250

225

0,0100

223

0,0100

221

0,0125

Razem

400

1,0000

98 Nr 2

PIŚMIENNICTWO

12. Fung W. K., Chung Y. K. i Wong D. M.: Power

of exclusion revisited: probability of excluding rela-

tives of the true father from paternity. Int. J. Legal

Med. 2002, 116, 64-67.

13. Berent J. A., Miścicka-Śliwka D. i Czarny J.:

Średnie wartości szansy ojcostwa – obliczenia dla

populacji polskiej. Arch. Med. Sąd. i Kryminol. 1999,

49, 11-15.

14. Brenner C., Morris J. W.: Paternity index cal-

culations in single locus hypervariable DNA probes:

validation and other studies. Proceedings from the

International Symposium on Human Identification

1989, Promega, Madison 1990, pp. 21-53.

15. Czarny J.: Population genetics of the STRs

D3S1358, FGA, D2S1338, D8S1179, D21S11,

D18S51 and D19S433 in the Pomerania-Kujawy re-

gion of Poland. Forensic Sci. Int. 2002, 125, 90-92.

16. Czarny J., Grzybowski T., Derenko M. V., Boris

A. M., Miścicka-Śliwka D.: Genetic variation of 15 STR

loci (D3S1358, vWA, FGA, TH01, TPOX, CSF1PO,

D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, D2S1338,

D8S1179, D21S11, D18S51, and D19S433) in po-

pulations of north and central Poland. Forensic Sci.

Int. 2005, 147, 97-100.

17. Miścicka-Śliwka D., Czarny J., Grzybowski

T., Woźniak M.: Population genetics of the STRs

vWA, TH01, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317,

D7S820, D16S539, LPL, F13B, FESFPS, F13A01

and ACTBP2 in the Pomerania-Kujawy region of

Poland. Forensic Sci. Int. 2001, 119, 110-122.

18. Grzybowski T.: Polimorfizm sekwencji mikro-

satelitarnej w obrębie drugiego ludzkiego pseudoge-

nu beta-aktyny (HUMACTBP2) i jego zastosowanie

w identyfikacji osobniczej. Rozprawa doktorska.

Akademia Medyczna im. Ludwika Rydygiera w Byd-

goszczy, Bydgoszcz 1998.

1. Lins A. M., Sprecher C. J., Puers C. i Schumm

J. W.: Multiplex sets for the amplification of poly-

morphic short tandem repeat loci – silver stain and

fluorescence detection. Biotechniques 1996, 20,

882-889.

2. Ricciardone M. D., Lins A. M., Schumm J. W.

i Holland M. M.: Multiplex systems fort he amplifica-

tion of short tandem repeat loci: evaluation of laser

fluorescence detection. Biotechniques 1997, 23,

742-747.

3. Płucienniczak A., Płucienniczak G., Mikiewicz

Mickiewicz., Jagiełło A., Dąbrowska H., Wojtuszek

E. i Chmiel A.: Oligonukleotydowe startery, sposób

analizy materiału genetycznego oraz zestaw do

analizy materiału genetycznego. Zgłoszenia paten-

towe nr 327759. Biuletyn Urzędu Patentowego RP

2000, 3, 681.

4. Płucienniczak A., Płucienniczak G., Mikiewicz

Mickiewicz., Jagiełło A., Dąbrowska H., Wojtuszek

E. i Chmiel A.: Oligonukleotydowe startery, sposób

analizy materiału genetycznego oraz zestaw do

analizy materiału genetycznego. Patent nr 187335.

Wiadomości Urzędu Patentowego RP 2004, 6, 1046.

5. Lewis P. O. i Zaykin D.: Genetic Data Analysis:

Computer program for the analysis of allelic data.

Version 1.0 (d16c), 2001, http://lewis.eeb.uconn.edu

/lewishome/software.html.

6. Berent J. i Szram S.: DLP – a computer pro-

gram for calculation of discrete locus parameters.

Forensic Sci. 2003, 1, 46-47.

7. Maddison D. R., Swofford D. L. i Maddison W. P.:

NEXUS: an extensive file format for systematic in-

formation. Syst. Biol. 1997, 46, 590-621.

8. Nei M. i Roychoudhury A. K.: Sampling va-

riants of heterozygosity and genetic distance. Ge-

netics 1974, 76, 379-390.

9. National Research Council Report II. The Eva-

luation of Forensic DNA Evidence. National Acade-

my Press, Washington, D.C. 1996, pp.96-97.

10. Botstein D., White R. L., Skolnick M. i Davis

R. W.: Construction of a genetic linkage map in man

using restriction fragment length polymorphism.

Am. J. Hum. Genet. 1980, 32, 314-331.

11. Weir B. S.: Genetic Data Analysis II. Sinauer

Associates, Inc. Publishers, Sunderland, Massachu-

setts 1996, pp.209-211.

Adres do korespondencji:

Dr hab. n. med. Jarosław Berent, prof. nadzw.

Zakład Orzecznictwa Sądowo-Lekarskiego

i Ubezpieczeniowego

Katedry Medycyny Sądowej

Uniwersytetu Medycznego w Łodzi

ul. Sędziowska 18a, 91-304 Łódź

Magdalena Spólnicka, Magdalena Konarzewska, Ireneusz Sołtyszewski, Jarosław Berent

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: