A cw 6 Badanie aktywności proteolitycznej.doc

Kierunek:  Technologia Żywności i Żywienie Człowieka

Przedmiot: Enzymologia

Temat ćwiczenia:

Badanie aktywności proteolitycznej enzymów wyekstrahowanych

z mięsa i wnętrzności ryb

Wprowadzenie:

Proces oczyszczania enzymów wymaga ciągłej kontroli zarówno jakościowej (wzrastająca czystość białka), jak i ilościowej (badanie stężenia interesującego enzymu i/lub jego aktywności). Kontrole jakościową wykonuje się wykorzystując techniki elektroforetyczne (zwłaszcza SDS-PAGE). Do oznaczania stężenia enzymów wykorzystywane są natomiast zazwyczaj techniki spektrofotometryczne, np. metoda Lowry’ego, metoda biuretowa. Oznaczanie aktywności enzymów wykonuje się w oparciu o ich zdolności katalityczne.

Stosuje się metodę Ansona, która opiera się na procesie hydrolizy zdenaturowanej hemoglobiny jako substratu. Na podstawie różnicy ilości PBH (produktów hydrolizy białka) w przesączach, otrzymanych po strąceniu roztworów 10% TCA, określa się aktywność proteolityczną badanego enzymu.

Badanie ilości produktów hydrolizy białka prowadzi się najczęściej metodą Lowry’ego. Jest to metoda kolorymetryczna, w której końcowa barwa jest wynikiem po pierwsze, reakcji biuretowej białka z jonami miedzi w środowisku zasadowym, czyli przyłączenia jonów miedzi do wiązań peptydowych, po drugie, redukcji odczynnika fosfomolibdeno-fosfowolframowego (odczynnik Folina-Ciocalteu) przez obecne w białku tyrozynę i tryptofan (redukcję barwy powodują także związane już jony miedzi, natomiast barwa powstająca przy nieobecności jonów miedzi pochodzi tylko od aminokwasów).

Celem ćwiczenia jest określenie i porównanie aktywności proteolitycznej enzymów wyizolowanych z mięsa i wnętrzności ryb.

Wykonanie ćwiczenia:

Zadanie 1. Rozmrozić uprzednio wyizolowane enzymy ryb i rozcieńczyć 5-krotnie.
W otrzymanych roztworach zbadać zawartość białka metodą biuretową oraz aktywność proteolityczną metodą Ansona.

Zadanie 2. Oznaczanie stężenia białka metodą biuretową:  Do kolbek odmierzyć po 0,5 cm3 kolejnych prób (do próby ślepej użyć wody destylowanej), dodać po 2 cm3 odczynnika miedziowego (wszystkie próby w 3 powtórzeniach). Po 30 min odczytać absorbancję przy długości fali 540 nm. Zawartość białka odczytać z krzywej wzorcowej (po uwzględnieniu zmętnienia), następnie zestawić wyniki, biorąc pod uwagę rozcieńczenie.

Zadanie 3. Oznaczanie aktywności proteolitycznej: Przygotować 6 probówek, do wszystkich wprowadzić po 0,5 cm3 roztworu enzymów. Do 3 probówek dodać po 2 cm3 hemoglobiny zdenaturowanej, wymieszać na wstrząsarce, inkubować 15 min w łaźni wodnej o temp. 37oC, a następnie dodać 2,5 cm3 10% TCA (kwas trichlorooctowy) i wymieszać. Próby odstawić na 15 min i przesączyć. W pozostałych probówkach przygotować próbę kontrolną, dodając do roztworu ekstraktu najpierw 2,5 cm3 10% TCA, a po wymieszaniu 2 cm3 hemoglobiny zdenaturowanej. Próby inkubować 15 min w temp. 37oC, następnie pozostawić na 15 min w temp. pokojowej i przesączyć.

W przesączach oznaczyć produkty hydrolizy białka metodą Lowry’ego oraz absorbancję przy dł. fali 280 nm. Różnica między próbą i próbą kontrolną będzie odpowiadać próbie właściwej.

Zadanie 4. Oznaczanie stężenia produktów hydrolizy białka zmodyfikowaną metodą Lowry’ego:

Przygotować 6 kolbek na każdą próbę oraz:

- 0,001 M NaOH,

- odczynnik A1 : 50 cm3 odczynnika A (węglan diodowy w NaOH) + 1 cm3 odczynnika B (siarczan miedzi w cytrynianie sodu, przechowywany w lodówce)

- rozcieńczony odczynnik Folina-Ciocalteu (odczynnik fosfomolibdeno-fosfowolframowego, rozcieńczenie: 20 cm3 odczynnika + 22 cm3 wody).

Do zlewki wlać 2 cm3 ekstraktu enzymu, dodać 0,001 M NaOH w ilości zależnej od stężenia enzymu, np. 8 cm3 (rozcieńczenie – w tym wypadku 5-krotne - uwzględnić w obliczeniach; w przypadku uprzedniego 5-krotnego rozcieńczenia enzymu, zastosować 2- lub 3-krotne rozcieńczenie ekstraktu, czyli np. 2 ml  + 4 ml NaOH). Do wszystkich kolb pobrać po 0,5 cm3 rozcieńczonego roztworu enzymów.  Do 3 kolb dodać 2,5 ml odczynnika A1. Po 10 min dodać po 0,25 ml rozcieńczonego odczynnika Folina-Ciocalteu, energicznie mieszając podczas dodawania (w przeciwnym razie nie przereaguje z całą miedzią, gdyż szybko się rozkłada). Po 30 min odczytać absorbancję przy dł. fali 750 nm. Ilość produktów hydrolizy białka należy obliczyć wg podanego wzoru (na podstawie krzywej wzorcowej).

PHB = A11,186 ∙ 887,88 ∙ R / 1000

Wyniki podać w mg/ml ekstraktu lub przeliczyć na 1 g substratu (mg/g), uwzględniając stężenie białka w próbie. Różnica między PHB próby właściwej i kontrolnej (P – K)
i stosunek tych wartości (P / K) mówią o aktywności proteolitycznej enzymu.

Wyniki zestawić w tabeli, uwzględniając różnorodność prób.

Przykład.

Zawartość produktów hydrolizy białka, oznaczonych metodą Lowry'ego w ekstraktach TCA hemoglobiny zdenaturowanej, poddanej działaniu enzymów [mg/g surowca].

P – K = 2,93 – 1,09 = 1,84 mg/g  

P/K = 2,93 : 1,09 = 2,7

Ilość produktów hydrolizy białka wzrosła o 169% w stosunku do próby kontrolnej.

Ilość produktów hydrolizy białka wzrosła 2,7 razy.

Zagadnienia do przygotowania:.

1.      Metody badań aktywności enzymów.

2.      Jednostki aktywności enzymów.

3.      Metody oznaczania stężenia białka i produktów hydrolizy białka..

Literatura:

1.      Dziuba J., Kostyra H.: „Biochemia żywności (metody, zadania i testy)”, Wydawnictwo UW-M w Olsztynie, Olsztyn 2000.

2.      Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.): „Ćwiczenia z biochemii”, PWN Warszawa - Poznań 1982.

3.      Kołakowski E., Bednarski W., Bielecki S. „Enzymatyczna modyfikacja składników żywności”, Akademia Rolnicza w Szczecinie, Szczecin 2005.

4.      Stryer L.: „Biochemia”, PWN Warszawa 1986.