Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów
Identyfikacja polega na określeniu przynależności badanego organizmu do odpowiedniej jednostki taksonomicznej, najczęściej gatunku.
Gatunek- populacja mikroorganizmów wykazujących wysoki stopień podobieństwa w ściśle określonym zakresie cech, a różniących się od innych gatunków tego samego rodzaju, np. Pseudomonas putida
Szczep- grupa drobnoustrojów potomnych jednej komórki
Szczep referencyjny (wzorzec)- izolat danego gatunku opisany jako pierwszy i najlepiej scharakteryzowany
Gatunek- wiele szczepów podobnych do siebie w ściśle określonym zakresie cech
Gatunek- grupa szczepów, w tym szczep referencyjny, wykazujący co najmniej 70% homologii genomowej DNA.
Cechy umożliwiające identyfikację bakterii:
· Morfologia
· Skład chemiczny ściany komórkowej
· Obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych
· Zdolność do tworzenia pigmentów
· Sposób odżywiania
· Wymagania pokarmowe, źródła C, N, S
· Skład jakościowy i ilościowy produktów fermentacji
· Wymagania tlenowe
· Zakres temperatur i pH wzrostu
· Wrażliwość na antybiotyki
· Patogenność
· Zależności symbiontyczne z innymi organizmami
· Środowisko występowania
· Obecność określonych antygenów (charakterystyka immunologiczna)
· Sekwencja DNA genomowego
Wszystkie te cechy bada się w czystych kulturach bakterii.
Metodą określenia czystości jest:
Posiew redukcyjny
Metoda posiewu rysą. /Kolonie tworzą się tylko na podłożach stałych/
Wstępne obserwacje i testy
· Barwienie Grama- budowa osłon komórkowych
· Barwienie proste- kształt i układ komórek
· Barwienie Wirtza- obecność lub brak przetrwalników
· Preparat w "kropli wiszącej"- ruchliwość
· Wytwarzanie katalazy- cecha organizmów tlenowych
2 H2O2 --> 2H2O + O2
W barwieniu Wirtza części wegetatywne zabarwiają się na czerwono od safraniny (?), przetrwalnikowe na malachitowo (seledynowy)
Wstępne obserwacje mikroskopowe
Pod mikroskopem stosujemy barwienie proste, rozpoznajemy kształty
Pałeczka- gruba parówa, laseczka- ekstra laska
Barwienie Grama wykorzystuje fakt występowania struktury jeszcze bardziej zewnętrznej niż ściana komórkowa- błony zewnętrznej. Gram ujemne- czerwony. Gram dodatnie- niebieski
Metody identyfikacji drobnoustrojów
Podział metod identyfikacji mikroorganizmów:
1. Biochemiczne
2. Biofizyczne
3. Immunochemiczne
4. Biologii molekularnej
Pierwsze 3 to metody fenotypowe, metoda 4 to metoda genotypowa
Fenotyp- cechy morfologiczne i fizjologiczne, charakteryzujące organizm w danej chwili, które kształtowane są przez warunki środowiskowe
Genotyp- całkowita informacja genetyczna zawarta w genach danej komórki; zapis wszystkich potencjalnych możliwości organizmu
Metody/ testy biochemiczne
Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych związków chemicznych.
Cechy biologiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych.
Wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo (wzrost lub jego brak, zmiana zabarwienia pożywki, reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z wytwarzanym metabolitem, wytworzenie gazu).
Test API
Zawieszenie --> Naniesienie --> Inkubacja --> Interpretacja wyników w teście API
Maksymalnie określa bakterie co do rodzaju (oprócz E. coli)
Metody biofizyczne
Umożliwiają identyfikację taksonomiczną mikroorganizmów w oparciu o analizę składu ich komponentów komórkowych, tj. białek lub kwasów tłuszczowych:
a. Techniki elektroforetyczne
b. Techniki oparte na chromatografii gazowej
Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych
Analiza profilu białkowego, tzw. "odcisku palca" drobnoustroju (ocena składu ilościowego i jakościowego wszystkich jego białek komórkowych) uzyskanego metodą SDS-PAGE
Sposób postępowania:
· Izolacja białek komórkowych czystej kultury mikroorganizmu
· Rozdział elektroforetyczny białek w żelu poliakrylamidowym na podstawie ich masy cząsteczkowej (małe przemieszczają się szybciej, większe wędrują wolniej)
· Barwienie rozdzielonych białek
· Porównanie z profilami białkowymi szczepów wzorcowych (porównanie na poziomie sekwencji numerycznych)
Profile białkowe przekształcone na wykresy typu x/y konwertuje się na sekwencje numeryczne, które następnie poddaje się analizom statystycznym tworząc na ich podstawie dendrogram.
Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową
Analiza profilu kwasów tłuszczowych (FAs) mikroorganizmu uzyskanego metodą GC/MS.
Analizie mogą podlegać całkowite, komórkowe FAs (metoda MIDI-FAME) lub FAs frakcji fosfolipidów, tzw. PLFAs, budujące błony komórkowe.
Kompozycja (skład jakościowy i ilościowy) FAs uwarunkowana genetycznie, jest unikalną, charakterystyczną cechą każdego gatunku.
· Saponifikacja i uwolnienie kwasów tłuszczowych
· Metylowanie
· Ekstrakcja z fazy wodnej
· Rozdział z zastosowaniem chromatografii gazowej
· Analiza wyników i porównanie z bazą danych
Biomarkerowe kwasy tłuszczowe:
Bakterie
Grzyby
Promieniowce
Bakterie redukujące siarczany
Metanotrofy
Metody immunochemiczne
Metody bazujące na wiązaniu typu antygen- przeciwciała, np. test immunoenzymatyczny (ELISA).
Efektywnymi antygenami są: białka, polisacharydy, jak i kwasy nukleinowe, drobnoustroje.
· Związanie przeciwciał swoistych dla interesującego nas antygenu= mikroorganizmu z polimerową płytką
· Nałożenie próby (źródła antygenu)
· Dodanie drugiego "wyznakowanego enzymatycznie" przeciwciała swoistego dla innego miejsca tego samego antygenu
· Dodanie substratu właściwego dla użytego enzymu
· Obserwacja makroskopowa (zmiana barwy, fluorescencja)
Na takiej zasadzie działają testy ciążowe.
Reakcja/ test aglutynacji
Cząstki lateksu opłaszczone swoistymi przeciwciałami- tylko właściwy mikroorganizm wiąże ze sobą te cząstki- następuje aglutynacja.
Metody biologii molekularnej
Metody identyfikacji oparte na badaniu homologii fragmentów kwasów nukleinowych. Wstępne kryterium- analiza zawartości GC (%GC) w DNA.
%GC= (nG + nC) / (nG + nC + nA + nT) * 100%
Gatunek- grupa szczepów różniących się zawartością GC w genomowym DNA nie więcej niż 3%.
Rodzaj- różnice w %GC nie mogą przekroczyć 10%.
rRNA uniwersalnym zegarem molekularnym
· Zawiera dużą ilość informacji do filogenezy
· Ma powszechne, stałe i wysoce zawężone funkcje ustalone na początku ewolucji
· Jest wysoce konserwatywny (stabilny)- niepodatny na wpływy środowiska (mutacje)
· Stopień odmienności między sekwencjami rRNA organizmów odpowiada zmienności wykazywanej przez ich genomy- czyli zmienność struktury pierwszorzędowej rRNA wśród organizmów odzwierciedla ewolucyjne dystanse między nimi.
16S rRNA- Procaryota
Technika PCR (nie służy do identyfikacji)
Enzymatyczna amplifikacja (wielokrotne skopiowanie) wybranego fragmentu DNA przeznaczonego do dalszych analiz genetycznych.
Potrzebujemy matrycę- wyjściowe DNA, mieszaninę wszystkich 4 zasad, primery i coś jeszcze
Doprowadzamy do denaturacji w temperaturze 94 stopni. Potem następuje przyłączanie primerów, następnie polimerazy.
Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP)
Technika wykorzystująca enzymy restrykcyjne zdolne do cięcia/ trawienia nici DNA w ściśle określonych miejscach. Stosowana tylko względem krótkich cząsteczek, np. fragmentu chromosomu.
Jedna z lepszych metod genetycznych, ściśle określa gatunek.
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych to spontaniczny proces łączenia się, w oparciu o komplementarność zasad azotowych, dwu jednoniciowych, obcych fragmentów DNA lub RNA i DNA.
Rozdzielenie helisy DNA lub RNA (tzw. Denaturacja) ma miejsce pod wpływem wysokiej temperatury i/lub substancji chemicznych.
Po usunięciu/ odmyciu czynnika denaturującego, nici łączą się ponownie, czyli ulegają renaturacji. Jeśli do takiej mieszaniny wprowadzi się obce nici kwasu nukleinowego, oprócz wyjściowych cząsteczek powstaną cząsteczki hybrydowe, stąd nazwa hybrydyzacja.
Metoda sondy molekularnej
· Sondy to krótkie jednoniciowe fragmenty DNA zawierające sekwencje unikalne dla organizmu
· Sonda molekularna jest znakowana radioaktywnie, fluorescencyjnie (barwnik) lub enzymatycznie
· Metoda hybrydyzacji bazująca na fragmentach DNA zwana jest metodą Southern'a ( ang. Southern blotting), wykorzystująca zaś RNA jako tarczę- metoda Northern (Northern blotting).
Sekwencjonowanie rDNA / rRNA
Polega na okresleniu kolejności nukleotydów we fragm genomowego DNA będącym genem kodującym rRNA, następnie porównywaniu tych danych z sekwencjami znanych gatunków i utworzeniu drzewa filogenetycznego.
Sposób:
· Amplifikacja fragmentu DNA (PCR)
· Sekwencjonowanie z użyciem sekwensera
· Porównanie wyników z zamieszczonymi w banku genów
Sekwencjonuje się przede wszystkim:
· Gen kodujący 16S rRNA prokariotycznych mikroorganizmów
· Gen kodujący 18S rRNA eukariotycznych mikroorganizmów
Ochroniacze1991