Mapowanie mejotyczne u drożdży – odczyt wyników. Zjawisko interferencji. Współczynnik koincydencji.

Część teoretyczna:

Cechy organizmu modelowego Neurospora crassa:

Neurospora crassa (nazwa potoczna – czerwona pleśń chlebowa) to grzyb z grupy workowców, odpowiedzialny m.in. za psucie się żywności, ale wykorzystywany jest także w analizie genetycznej. Grzyby te wytwarzają długie podzielone strzępki grzybni powietrznej, tworzące luźną siatkę. Na końcach strzępki rozgałęziają się na łańcuchy owalnych konidiów wytwarzających czerwony pigment. Podobnie jak Saccharomyces cerevisiae wykazuje zjawisko heterotalizmu (zdolność do rozmnażania płciowego mają strzępki grzybni o przeciwnych typach płciowych A i a). Może rozmnażać się w dwojaki sposób:

1. bezpłciowo – dzięki 1-komórkowym zarodnikom (konidiom) lub przez fragmentację strzępek grzybni (Rys.1)
2. płciowo – polega na połączeniu strzępek grzybni o różnych typach koniugacyjnych A i a. W ten sposób powstaje heterokarion – komórka posiadająca 2 różne genetycznie haploidalne jądra (jest to odpowiednik diploidalnej heterozygoty, ponieważ u Neurospora nie ma fazy diploidalnej). Po fuzji jąder powstaje diploidalne jądro, które szybko przechodzi 2 podziały mejotyczne i mitozę w ten sposób powstaje worek (ascus) z 8 zarodnikami (askosporami, zarodnikami workowymi). Worki powstają w narządzie zwanym otocznią (perytecjum, klejstotecjum). W sprzyjających warunkach haploidalne zarodniki kiełkują dając początek haploidalnym strzępkom grzybni wegetatywnej (Rys.1).

Rys. 1. Cykl rozwojowy Neurospora crassa. A i a oznaczają typ koniugacyjny łączących się strzępek grzybni wegatetywnej. Źródło: Sadakierska-Chudy A., Dąbrowska G., Goc A: Genetyka ogólna. Skrypt do ćwiczeń dla studentów biologii

1

Mapowanie genów metodą analizy tetrad u Neurosora crassa

U Neurospora występują worki uporządkowane, tzn. worki są tak wąskie, że dzielące się jądra nie mogą zmienić swojego położenia (i np. się „wyminąć”), stąd układ askospor jest dokładnym odzwierciedleniem segregacji chromosomów i chromatyd zachodzących podczas mejozy. Zatem po kolejności spor w worku można ustalić czy doszło do c-o (ang. crossing over ) czy też nie.

Aby ocenić genotypy askospor, należy je wypreparować z worka (np.używając mikromanipulatora), zachowując kolejność ich ułożenia, poddać kiełkowaniu i określić fenotyp każdej kolonii, który jest odzwierciedleniem ich genotypu.

Za pomocą analizy tetrad można ustalić czy zaszło crossing over, a co za tym idzie:

·         sprzężenie genów

·         jak segregują allele tych genów w mejozie

·         odległość między genami lub między genem a centromerem, czyli zmapować geny na chromosomie

U Neurospora crassa mogą powstawać 2 typy worków, które bezpośrednio umożliwiają określenie czy zaszedł crossing over czy też nie. Są to worki:

1. 1. z preredukcją – jeśli allele segregują w I podziale mejotycznym, nie zachodzi, centromery chromosomów zawsze rozdzielają się w I podziale meojotycznym, wówczas otrzymuje się układ askospor 4:4 (np. 4 jasne, 4 ciemne)

Układ askospor w workach po preredukcji.

Kolejność ułożenia jasne-ciemne lub ciemne –jasne zależy od tego, który allel powędrował do górnego, a który do dolnego bieguna

2. 2. z postredukcją – jeśli allele segregują w II podziale, dochodzi do wymiany chromatyd między chromosomami homologicznymi (zachodzi c-o na odcinku między genem a centromerem), wówczas otrzymuje się układ askospor 2:2:2:2 lub 2:4:2. Im dalej gen znajduje się od centromeru, tym więcej worków z postredukcją, ponieważ łatwiej zachodzi c-o. % ilość worków z postredukcją wskazuje na odległość genu od centromeru.

Segregacja alleli ciemnej i jasnej barwy u Neurospora crassa w zależności od tego, które chromatydy uczestniczą w crossing over.

Ciekawostki

W 1958 roku Lawrie E. i Beadle E.W. otrzymali Nagrodę Nobla w zakresie medycyny i fizjologii za odkrycie roli enzymów w sterowaniu reakcjami biochemicznymi w organizmie, na podstawie badań przeprowadzonych nad grzybami z gatunku Neurospora crassa.

Beadle i Tatum na podstawie wyników badań na licznej grupie mutantów z defektami w różnych szlakach metabolicznych z wykorzystaniem Neurospora wysunęli hipotezę: 1 gen – 1 łańcuch polipeptydowy (1 enzym).

W kwietniu 2003 roku został ukończony projekt sekwencjonowania genomu Neurospora crassa.

Zjawisko interferencji. Współczynnik koincydencji.

W celu ustalenia odległości między genami uwzględnia się częstość zachodzenia c-o, w tym zachodzenia podwójnego c-o na pewnym odcinku chromosomu, np. pomiędzy genem A i B; B i C.

A

X

B

X

C

                                                                 0,2 cM                       0,3 cM

Zgodnie z zasadą: „ jeżeli dwa zjawiska zachodzą niezależnie od siebie, to prawdopodobieństwo ich jednoczesnego wystąpienia jest iloczynem prawdopodobieństw każdego z nich”, jeżeli c-o zachodzi w obu odcinkach niezależnie od siebie, to podwójnego c-o powinniśmy oczekiwać z częstością wynikającą z iloczynu odległości między genami A i B ; B i C (0,2 x 0,3 = 0,06 = 6%). W rzeczywistości prawdopodobieństwo zajścia podwójnego c-o jest niższe niż wynika z powyższych obliczeń ze względu na:

a.       możliwość zajścia, pomiędzy genami daleko oddalonymi od siebie, podwójnego, poczwórnego c-o, w wyniku czego powstają formy fenotypowo niezrekombinowane.

b.      zjawisko interferencji (chromosomowej) czyli najczęściej hamującego wpływu jednego c-o na równocześnie zachodzący drugi c-o w danym odcinku chromosomu. Im mniejsza odległość między genami tym większa interferencja.

Natężenie interferencji oznacza się współczynnikiem koincydencji. Jest to stosunek obserwowanej do oczekiwanej częstości podwójnego c-o i wyraża się wzorem:

                                   Częstość obserwowana (rzeczywista) podwójnego c-o

                  Wk =

                              Częstość oczekiwana podwójnego c-o

Częstość obserwowaną 2 c-o wylicza się na podstawie iloczynu częstości zajścia pojedynczych c-o w danym odcinku chromosomu.

Współczynnik koincydencji zmienia się odwrotnie proporcjonalnie do interferencji i przyjmuje wartość od 0 do 1.

Jeśli:

Wk = 0  ® występuje całkowita interferencja, tzn. 1 c-o całkowicie hamuje zajście drugiego

Wk = 1 ® brak interferencji, tzn. tyle się obserwuje podwójnego c-o ile oczekuje

Opracowanie: dr Ewa Maciaszczyk

Część praktyczna:

1.      Omówienie kolokwium.

2.      Odczyt wyników replikacji matryc i zestawienie ich w tabeli: