V-Koniugacja bakterii.doc

Koniugacja bakterii Escherichia coli.

Część teoretyczna:

U bakterii znane są trzy sposoby wymiany materiału genetycznego, niezależnie od procesu rozmnażania płciowego. Są to bardzo ważne zjawiska, umożliwiające stałe zwiększanie różnorodności wśród bakterii. Należą do nich:

1.      Koniugacja – bezpośrednie przekazywanie materiału genetycznego z 1 komórki (dawcy) do komórki (biorcy), kiedy wchodzą one ze sobą w kontakt. Odgrywa największe znaczenie w wymianach materiału genetyczengo.

2.      Transformacja – proces pobierania „nagiego” DNA ze środowiska

3.      Transdukcja – przeniesienie DNA z komórki dawcy do biorcy, nie wymagające ich bezpośredniego kontaktu, ponieważ odbywające się przez bakteriofaga (wirus atakujący bakterie). Zazwyczaj zostaje przeniesiony tylko fragment DNA dawcy. Wyróżnia się 2 rodzaje transdukcji:

a.       Niespecyficzna (=ogólna) – gdy każdy segment DNA dawcy może zostać przeniesiony

b.      Specyficzna – gdy przekazane mogą być tylko określone segmenty DNA.

Koniugacja

Po raz pierwszy zjawisko to zostało opisane u E. coli przez Lederberga i Tatuum w 1946 roku.

Jest to proces jednokierunkowego przekazywania materiału genetycznego wśród bakterii, zawsze od komórki biorcy (F+ lub Hfr) do komórki dawcy (F-).

Różnica pomiędzy komórkami F+ i F- polega na występowaniu w komórkach F+ i Hfr plazmidu koniugacyjnego (plazmidu F). Zatem,

·         Komórki F- - nie posiadają plazmidu F

·         Komórki F+ - posiadają plazmid F w postaci wolnej, kolistej cząsteczki DNA w cytoplazmie

·         Komórki Hfr (ang. high frequence of recombination) – posiadają plazmid F w postaci liniowej, zintegrowany do chromosomu bakteryjnego wg mechanizmu: (1) homologicznej rekombinacji; (2) opartego na transpozycji elementów IS (niezależnie od białka RecA)

Plazmid koniugacyjny F

Przykład plazmidu samoprzenoszącego się, episomu. Występuje w wielu gramujemnych bakteriach innych niż E. coli. Wykazano również ich obecność w rodzajach: Bacillus, Clostridium, Nocardia, Streptococcus. Jego obecność nadaje komórkom zdolność do produkcji pilusów (fimbrii) płciowch F (ang. fertile), które warunkują kontakt między koniugacyjnymi komórkami. Pilusy są to cylindryczne twory zbudowane z białka piliny, kodowanego przez gen traA.

oriV – początek replikacji (ang. origin of replication)

oriT – początek transferu koniugacyjnego

tra – region związany z fukcją koniugacji i transferu (ang. transfer)

gd - transpozon Tn1000

IS3, IS2 – sekwencje insercyjne  (ang. insertion sequence)

Schemat plazmidu (czynnika) F

Obecność sekwencji:

·         OriV – umożliwia replikację niezależnie od chromosomu bakteryjnego

·         IS – umożliwiają integrację do chromosomu bakteryjnego w kilku miejscach na drodze rekombinacji w obrębie regionów IS, które obecne są również w chromosomie

·         Regionu tra – koduje białka wymagane do stabilizacji koniugacyjnych partnerów, do procesu przekazywania DNA i jego regulacji oraz wykluczenia z komórki innych plazmidów. Obejmuje około 30000 pz i 31 genów.

Sekwencje IS:

Ø      Należą do elementów zdolnych do transpozycji;

Ø      Mogą włączać się w wielu miejsca genomu bez konieczności występowania homologii sekwencji (dzięki temu są bardzo „ruchliwe”);

Ø      Są obecne w bakteryjnym chromosomie, plazmidach, fagach, wirusach i komórkach eukariotycznych;

Ø      Składają się z 800 –1400 pz i prawdopodobnie kodują cechy związane z transpozycją;

Ø      Na końcach zawierają proste lub odwrócone powtórzenia sekwencji komplementarnych;

Ø      Transpozycja jest katalizowana przez enzym transpozazę, kodowaną przez IS, która rozpoznaje końce IS i regiony docelowe dwuniciowego DNA;

Ø      Mogą spełniać ważną rolę w zmianie ułożenia i rekombinacji genów.

Etapy koniugacji:

1.      kontakt pomiędzy dawcą a biorcą przez włosowate (2,3) pilusy, co prowadzi do powstania tzw. „krzyżowych agregatów”, kontakt ten bardzo łatwo jest przerwać np. przez przypadkowe poruszenie komórek, stąd produkty wielu genów tra (tzw. kompleks mpf ang. mating-pair formation) stabilizują i utrzymują ten kontakt. Obecnie nie jest znany kanał, przez który odbywa się transfer DNA, na pewno nie jest to pilus, być może stanowi go białko błonowe traD (Rys. 1);

2.      transfer czynnika F rozpoczyna się jednoniciowym pęknięciem wiązania fosfodiestrowego w regionie stanowiącym początek koniugacyjnej replikacji (oriT); odpowiedzialny za to jest wieloenzymowy kompleks głównie enzym nikaza-helikaza;

3.      DNA zostaje rozwinięty w kierunku 5’ do 3’, począwszy od oriT. Proces ten katalizowany jest przez 2 białka i wymaga nakładu energii pochodzącej z hydrolizy ATP;

4.      pojedyncza nić przechodzi przez kanał koniugacyjny do komórki biorcy, poczynając od końca 5’ (w zasadzie jest „pchana” przez region tra);

5. synteza nici komplementarnych. U dawcy odbywa się w sposób ciągły od końca 3’ wg mechanizmu „toczącego się koła”, u biorcy zachodzi nieciągle, z wykorzystaniem starterów RNA.

Rys. 1. Model przekazywania plazmidu F z komórki dawcy do biorcy podczas koniugacji.

Po pęknięciu 1 nici DNA w miejscu oriT, pojedyncza nić zostaje przekazana przez kanał koniugacyjny do komórki biorcy, poczynając od końca 5’. W komórce dawcy dwuniciowy DNA ulega rozwinięciu przez helikazę I, a przekazana nić zostaje odtworzona w wyniku ciągłej syntezy DNA od końca 3’. W komórce biorcy nić komplementarna jest syntetyzowana w sposób nieciągły.

Źródło: Piątkowski J. Genetyka w ćwiczeniach.

Koniugacja pomiędzy F- i F+

W wyniku koniugacji komórek F+ z F- z bardzo dużą częstością powstają komórki F+, ale bardzo rzadko przekazywane są markery bakteryjne kodowane przez chromosom bakteryjny dawcy (niski poziom uzyskiwania rekombinantów). Rys. 2.

Czas niezbędny do przekazania całego plazmidu F wynosi około 100 minut.

(1) komórka dawcy kontaktuje się z komórka biorcy za pomocą pili płciowych

(2) przekazywanie plazmidu F rozpoczyna się po nacięciu 1 nici DNA przez helikazę w obrębie sekwencji oriT; do komórki biorcy przekazywana jest tylko 1 nić od końca 5’

(3) drugie nici DNA są syntetyzowane w komórce dawcy i biorcy. Po zakończeniu syntezy DNA jest nacinany w miejscu cięcia uwalniając 2 cząsteczki DNA. Dwuniciowe DNA w komórce biorcy ulega cyrkularyzacji.

(4) po zakończeniu transferu czynnika F komórki rozdzielają się. Zarówno komórka dawcy jak i biorcy zawierają kompletny plazmid F i mogą koniugować z innymi komórkami F-.przekazywanie plazmidu F rozpoczyna się po nacięciu 1 nici DNA przez helikazę w obrębie sekwencji oriT; do komórki biorcy przekazywana jest tylko 1 nić od końca 5’

Rys. 2. Koniugacja pomiędzy bakteriami F+ i F-.

Koniugacja pomiędzy F- i Hfr

W wyniku koniugacji komórek Hfr i F-, komórki biorcy w dużej części nadal pozostają F-, ale jest wysoka częstość uzyskiwania rekombinantów (około 1000 razy większa niż w przypadku koniugacji F- z F+), ponieważ w zasadzie zawsze dochodzi do przekazania komórce biorcy pewnego fragmentu genomu dawcy (Rys. 3). Region tra przekazywany jest na końcu, dlatego nie zawsze dostaje się do komórki biorcy.

Rys. 3. Koniugacja pomiędzy bakteriami Hfr i F-.

Podczas przekazywania genów pomiędzy Hfr a F- stwierdzono, że:

·         czas przekazywanie genów jest różny i charakterystyczny dla każdego genu

·         czas przekazywania genów jest zgodny z kolejnością ułożenia genów na chromosomie (im dalej gen od punktu początkowego, tym później zastaje i tym rzadziej może być przekazany)

·         każdy szczep Hfr przekazuje geny do komórki biorcy z określonego punktu startowego i w określonym kierunku

·         długość przekazywanego fragmentu zależy od czasu trwania połączenia między parą koniugujących ze sobą komórek

·         zawsze towarzyszy replikacja DNA rozpoczynająca się w miejscu insercji czynnika F, a koniec 5’ nowo syntetyzowanej nici wchodzi jako pierwszy do komórki biorcy

·         rekombinacja homologiczna pomiędzy DNA biorcy i dawcy zachodzi natychmiast po przekazaniu DNA z komórki dawcy

Czynnik F może zostać wycięty z chromosomu (ulega rewersji) wówczas komórki Hfr stają się F+ . Jeśli dojdzie do niewłaściwego wycięcia czynnika F z chromosomu bakteryjnego, co prowadzi do powstania czynnika F z odcinkiem chromosomowego DNA, takie komórki określane są jako F’ (tzw. pierwotne komórki F’). W wyniku koniugacji F- z F’ powstaje wtórna komórka F’, która zawiera czynnik F oraz zduplikowany fragment chromosomu pochodzący od dawcy.

Koniugację wykryto również u bakterii gramdodatnich np. Streptomyces, Mycobacterium, Corynebacterium, Rhodococcus, ale proces ten jest tylko częściowo poznany.

Znaczenie koniugacji

Zanim został zsekwencjonowany genom E. coli, stosując technikę przerywanej koniugacji (koniugacja pomiędzy F- a Hfr przerywana po określonym czasie w celu ustalenia, które geny z Hfr zostały przekazane do biorcy) można było dokonać mapowania genów a jednostką mapową były minuty (po których przerywano koniugację). Technika te jednak nie pozwalała na określenie okresów mniejszych niż 1 minuta.

Ciekawostki

U bardzo licznych bakterii gramdodatnich i gramujemnych występują transpozony koniugacyjne. Są to mobilne elementy DNA, kodujące wszystkie niezbędne funkcje dla wewnątrzkomórkowej transpozycji i zewnątrzkomórkowej koniugacji (obecność sekwencji oriT). Prawdopodobnie są one ważnym elementem w rozprzestrzenianiu się genów oporności na antybiotyki, np. tetracyklinę (transpozon Tn916 z E. faecalis). Ich częstość przekazywania wynosi od 10-4 do 10-9.

Opracowanie: dr Ewa Maciaszczyk

...