Diagnostyka bakterii beztlenowych przetrwalnikujących

Bakterie beztlenowe można podzielić na przetrwalnikujące i nieprzetrwalnikujące.

Bakterie beztlenowe nieprzetrwalnikujące należą do różnych rodzajów bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich.

Pałeczki Gram-ujemne:

Grupa Bacteroides fragilis

Grupa Bacteroides ureolyticus: Wolinella, Fusobacterium, Porphyromonas, Prevotella, Mobiluncus, Megamonas, Selenomonas, Leptotrichia, Anaerospirillum;

Pałeczki Gram-dodatnie: Propionibacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Actinomyces, Lactobacillus;

Ziarniaki Gram-ujemne:Veillonella;

Ziarniaki Gram-dodatnie: Peptostreptococcus.

Bakterie beztlenowe przetrwalnikujące obejmują rodzaj Clostridium.

Znanych jest ok. 100 gatunków tego rodzaju, z czego ponad 40 izolowano dotąd od ludzi. Niektóre z tych gatunków wchodzą w skład flory kolonizującej błony śluzowe różnych układów, najczęściej przewodu pokarmowego. Często są spotykane w kale ludzi zdrowych.

Wszystkie bakterie z rodzaju Clostridium to Gram-dodatnie laseczki, wytwarzające przetrwalniki. Większość produkuje toksyny i enzymy toksyczne, odpowiedzialne za wywoływanie określonych zmian w tkankach (skurcz mięśni, zaburzenia przewodnictwa w o.u.n., porażenia spastyczne, zmiany martwicze i inne).

Za toksykoinfekcje odpowiedzialne są głównie:

·         Clostridium perfringens — zgorzel gazowa (w połączeniu z innymi gatunkami 2, 3 lub więcej, np. Clostridium septicum, Clostridium novyi, Clostridium sporogenes lub Clostridium histolyticum, Clostridium bifermentans, Clostridium sordelli lub innych)

·         Clostridium septicum - obrzęk złośliwy – zgorzel gazowa

·         (często w skojarzeniu z Clostridium butiricum, Clostridium baratii, Clostidium haemolyticum)

·         Clostridium botulinum - zatrucie jadem kiełbasianym

·         Clostridium difficile - rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego po antybiotykoterapii, zespół AAC

·         Clostridium tetani - tężec

Komórki wegetatywne z młodych hodowli barwią się Gram-dodatnio, natomiast ze starych Gram-ujemnie.

Wytwarzają przetrwalniki umieszczone w komórce centralnie, terminalnie lub subterminalnie, stąd komórki przypominają wyglądem osełkę, rakietę tenisową, pałeczkę dobosza (laseczka tężca) lub maczugę (można obserwować w preparatach barwionych metodą Schaeffera-Fultona).

Należą do drobnoustrojów beztlenowych dlatego muszą być hodowane w warunkach beztlenowych.

Podłoża płynne

·         bulion tioglikolanowy (bioMerieux – bulion tioglikolanowy z rezazuryną jako wskaźnikiem stopnia natlenienia podłoża); tioglikolan sodu obniża potencjał oksydo-redukcyjny podłoża

·         bulion Schaedlera do izolowania względnych i bezwzględnych beztlenowców; obecność heminy, ekstraktu drożdżowego, witaminy K3 ułatwia rozwój bakterii o bardzo wysokich wymaganiach wzrostowych

Podłoża stałe

·         agar Columbia

·         agar Columbia + 5% krwinek baranich + gentamycyna (nie działa na beztlenowce)

·         agar Schaedlera

·         agar Schaedlera + 5% krwinek baranich

·         TSN Agar (Trypcase, Sulfite, Neomycin (bioMerieux) - podłoże do izolacji Clostridium perfringens)

Systemy do hodowli drobnoustrojów beztlenowych

·         system, który składa się ze szczelnej koperty z przezroczystego plastiku, która umożliwia dzięki generatorowi, szybkie uzyskanie atmosfery potrzebnej do hodowli szczepów beztlenowych. Generator zawiera mieszaninę sproszkowanego żelaza, kwasu cytrynowego i dwuwęglanu sodu. Po dodaniu wody następuje usunięcie tlenu i wzbogacenie atmosfery w CO2, co zapewnia szybki wzrost hodowli beztlenowej np. Generbag anaer (bioMerieux), Anaerocult P, C mini, A mini (Merck)

·         system, który składa się z puszki (2.5  litrowy zbiornik ze stali nierdzewnej lub przejrzystego plastiku), generatora umożliwiającego uzyskanie warunków beztlenowych

·         Generbox anaer (bioMerieux) - generator w postaci koperty, która zawiera 3 tabletki z hydroboranem sodu, dwuwęglanem sodu i kwasem cytrynowym, które mogą wytworzyć około 1,850 ml wodoru i 190 ml dwutlenku węgla. Koperta „beztlenowa" umożliwia otrzymanie warunków beztlenowych w obecności czynnego katalizatora (aluminium opłaszczone 0.5% palladem). W kopercie znajduje się także wskaźnik - pasek nasycony roztworem błękitu metylenowego, czynnika redukującego i stabilizatora. Część reagująca, koloru niebieskiego, odbarwia się w warunkach beztlenowych (reakcja ta może trwać kilka godzin)

·         Anaerocult A (Merck) - generator w postaci koperty umożliwiający po dodaniu wody bez katalizatora uzyskanie warunków beztlenowych w przejrzystej plastikowej puszce mieszczącej 12 płytek Petriego. Wskaźnik warunków beztlenowych - błękit metylenowy stosowany jest w postaci pasków (Anaerotest).

Bakterie z rodzaju Clostridium

·         nie wytwarzają katalazy

·         nie wytwarzają oksydazy cytochromowej nie wytwarzają peroksydazy

Przy identyfikacji bakterii beztlenowych powinny być uwzględnione takie cechy jak:

·         test na tolerancję tlenu (przesiew na podłoże i hodowla w warunkach tlenowych)

·         morfologia kolonii barwienie metodą Grama

·         ruch

·         testy biochemiczne produkty metaboliczne (GLC)

·         wrażliwość na antybiotyki testy serologiczne

Ostatnio również wprowadzono sondę genetyczną. Do identyfikacji biochemicznej dostępne są gotowe zestawy handlowe:. API 20 A z 24 godzinną inkubacją w warunkach beztlenowych i Rapid ID 32 A w ramach systemu ATB Expressibn (bioMerieux) – test 4 godzinny nie wymagający inkubacji beztlenowej.