7. Profil_transkrypcji_-_metoda_SAGE.pdf

Profil transkrypcji – metoda

SAGE; białka struktura i funkcja

SAGE

Serial analysis of Gene Expression

Materiał wyjściowy: mRNA z polyA

1. Annealing do sekwencji poly dT

związanej z biotyną

2. Synteza cDNA

3. Trawienie enzymem restrykcyjnym

(kotwiczącym, AE)

4. Ligacja dwóch typów sekwencji

zawierających sekwencję „tagging

enzyme” (TE)

5. Cięcie enzymem TE

6. Łączenie krótkich sekwencji tag w

ditagi

7. Multiplikacja ditagów za pomocą

PCR

8. Odcięcie sekwencji TE i

końcowych sekwencji starterowych

9. Ligacja wielu ditagów i ich

klonowanie

10. Sekwencjonowanie klonów

SAGE – Serial Analysis of Gene Expression

SAGE pozwala na detekcję

sekwencji nukleotydowych

poszczególnych genów w próbce

i analizę ilościową ekspresji

genów w komórkach

1. Biotynylowane oligo(dT) jest starterem do

syntezy cDNA. cDNA jest izolowane przez

przyłączenie do granulek związanych ze

streptawidyną

Produkty PCR zawierają

ditagi powiązane z

sekwencjami łącznikowymi

2. Restryktaza rozpoznająca

sekwencje 4pz przecina każdy odcinek

cDNA przynajmniej w jednym

miejscu

3. Ligacja fragmentów

zawierających miejsca

restrykcyjne dla enzymu

4. Powstale przez konkatemeryzację ditagów klony zawierają co najmniej 10-50

fragmentów (tags)

Analiza sekwencyjna otrzymanych

konkatemerów pozwala na porównanie

i ewentualną identyfikacje wieluset

transkrybowanych sekwencji

a także wykrywanie nowych genów

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: