Ogólny podział:

1.      W zależności od składu i funkcji podłoża dzielimy na:

-          proste

-          wzbogacone

-          specjalne

-          wybiórcze (selektywne)

-          różnicujące

-          transportowe

-          transportowo-wzrostowe

2.      Ze względu na konsystencję pożywki:

-          stałe (dodatek agaru; żelatyny; żelu krzemionkowego. Agar –dodany w stężeniu – 0,5 – 1% = podłoże półpłynne; 1,5-3% = podłoże stałe)

-          płynne

Najprostszym podłożem płynnym jest:

·         bulion mięsny – wyciąg mięsny + 1% peptony + 0,5% NaCl

·         bulion drożdżowy – wyciąg drożdżowy + pepton + NaCl

Podłoża wzbogacone: są to podłoża z dodatkiem krwi, surowicy lub innych składników, zawierających dodatkowe czynniki wzrostowe, które umożliwiają hodowlę i rozwój najbardziej wybrednych pod względem odżywczym bakterii

Podłoża specjalne: są to podłoża z dodatkiem węglowodanów lub innych specyficznych substratów. Służą m.in. do określania cech hodowanych drobnoustrojów np. właściwości fermentacyjnych  danego drobnoustroju, lub do wytwarzania specyficznych produktów metabolizmu takich jak: toksyny, antybiotyki itd. Przykładem podłoży specjalnych są pożywki wchodzące w skład tzw. szeregów biochemicznych używanych do identyfikacji bakterii – podłoże Kliglera, podłoże Stuarta (wykrywanie urezay)

Podłoża różnicujące: są to podłoża gdzie może rosnąć kilka lub kilkanaście gatunków drobnoustrojów, ale każdy z nich wytwarza charakterystyczne, łatwe do zróżnicowania kolonie, co pozwala na ich szybką i dalszą, już ukierunkowaną, szczegółowa identyfikację.

Stałe podłoża różnicujące często są jednocześnie wybiórczymi dla określonej grupy, rodzaju drobnoustrojów i są nazywane wybiórczo-różnicującymi.

Podłoża wybiórczo-różnicujące: np.

·         podłoża do hodowli bakterii z rodziny Enterobacteriaceae: MacConkey, Endo, SS, Levina; podłoża do hodowli maczugowców: podłoże Clauberga z tulerynem potasu

·         podłoże do hodowli gronkowców: podłoże Champamana

·         podłoże do hodowli grzybów i pleśni: podłoże Saburoda

Podłoża wybiórcze: są to podłoża z dodatkiem takim substancji, które umożliwiają wzrost tylko pewnych określonych gatunków bakteryjnych czy grzybiczych a jednocześnie hamują wzrost innych gatunków. Podłoża te pozwalają na wyizolowanie jednego lub kilku gatunków bakteryjnych czy grzybiczych z materiału, w którym znajduje się cała masa drobnoustrojów.

Np. podłoże z dodatkiem fioletu krystalicznego, które umożliwia wzrost tylko bakterii Gram-ujemnych, podłoże do hodowli prądków – Löwenssteina-Jensena, różne podłoża selektywne do hodowli bakterii z rodzaju Campylobacter, Yersinia, Vibrio, gatunków Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, itd.; wiele z nich zawiera antybiotyki jako składnik selekcjonujący drobnoustroje.

Do podłoży dodawane są barwniki (wskaźniki), które zmieniają swoje zabarwienie w zależności od pH podłoża (często jest to błękit bromotymolowy, czerwień fenolowa, purpura bromkokrezolowa i inne).

Przy podłożach wybiórczo-różnicujących zmiana zabarwienia w czasie wzrostu określonego drobnoustroju informuje o określonej właściwości w zależności od danego substratu (np. rozkład laktozy, manitolu itd.)

Hodowla drobnoustrojów może być prowadzona:

·         w warunkach tlenowych – cieplarki 35°- 37° C lub 22°-30°C, 42°C

·         w warunkach mikroaerofilnych (eksykatory i generatory wytwarzające gaz i/lub jego mieszaniny o określonym stosunku ilościowym i/lub procentowym np. CO2; H2+CO2

·         w warunkach beztlenowych – generatory z gotową

Czas inkubacji hodowli:  24h do 7 doby/ dla grzybów niedoskonałych - 14 dni

Metody hodowli drobnoustrojów, połączone z wyosobnieniem i identyfikacją, nazywane metodami konwencjonalnymi (klasycznymi) pozostają do chwili obecnej referencyjne w diagnostyce mikrobiologicznej.

Do hodowli bakterii i grzybów najczęściej wykorzystywane są podłoża stałe, rzadziej płynne.

Posiew materiałów oraz posiewy bakterii lub grzybów na podłoża stałe dokonywany jest przy użyciu ezy: platynowe, z drutu Kanthalowego, plastikowe =jednorazowe

Najczęściej stosowana technika = technika posiewu redukcyjnego (technika posiewu z izolacją).

Posiew redukcyjny

Kolonia bakterii i/lub grzyba

Izolacja drobnoustrojów

Kolonia jest zbiór komórek wyrastających na podłożu stałym, widoczny gołym okiem.

Przyjmuje się (w posiewach półilościowych i ilościowych), że jedna kolonia odpowiada jednej komórce bakteryjnej lub grzybiczej.

Zamiast liczby komórek przypadających na g (gram) lub ml (mililitr), wprowadzono do badań ilościowych określenie cfu (ang. colony forming units), czyli jednostki tworzące kolonie.

Przy opisie kolonii (osobnik I rzędu) = MORFOLOGIA KOLONII najczęściej bierze się pod uwagę:

1.      kształt – okrągły, owalny, nieregularny, postrzępiony, gwiazdkowaty, promienisty, soczewkowaty, głowa meduzy i inne,

2.      wielkość – średnica kolonii w mm,

3.      brzeg – równy, falisty, zatokowaty, postrzępiony, poszarpany, ząbkowany i inny;

4.      powierzchnia – gładka, szorstka, drobno- lub gruboziarnista, pomarszczona matowa, błyszcząca, brodawkowata itp.;

5.      struktura – bezkształtna, szorstka, nitkowata, ziarnista i inne;

6.      wyniosłość ponad powierzchnię – brak, wypukła, płaska, stożkowata, o wyniosłym brzegu i zapadłym środku, kopulasta ze środkiem wzniesionym w postaci guziczka, itp.;

7.      kolor – barwa w świetle odbitym i przepuszczalnym, zabarwienie samej kolonii, zabarwienie podłoża (barwniki rozpuszczalne). Najczęstsze barwy – biała, żółta, pomarańczowa, czerwona, czarna, zielona, niebieska, brązowa, i inne;

8.      przejrzystość – przejrzysta, mętna, przeświecająca, opalizująca, nieprzejrzysta

9.      konsystencja – masłowata, sucha, lepka, błoniasta, skórzasta, ciągła, śluzowata,

10.  zapach – mdławy (np. Pseudomonas aeruginosa = kredki świecowe, jaśmin), kwaśne = gronkowce, piwa, miodu, gliny itp.,

11.  zawieszalność – zdolność do tworzenia jednolitej zawiesiny w roztworze soli fizjologicznej – łatwa; niezawieszalna – grudkowa,

12.  inne cechy, takie jak: typ hemolizy na podłożu z dodatkiem krwi:

-          typ β – całkowita liza wokół kolonii

-          typ α – częściowa liza, zazielenienie wokół kolonii

-          typ γ – brak hemolizy

Typy wzrostu na podłożach płynnych, jako ocena morfologii niektórych drobnoustrojów, wiążą się ściśle ze sposobem oddychania.

Drobnoustroje tlenowe rosną na powierzchni podłoża płynnego; względne beztlenowce powodują zmętnienie całej pożywki, a beztlenowce tworzą osad na dnie próbówki – np. wzrost drobnoustrojów na podłożu półpłynnym Schedlera.

Podłoża opis:

Agar MacConkey – podłoże wybiórczo-różnicujące; służy do izolacji pałeczek Gram-ujemnych z materiałów klinicznych. Jest to podłoże diagnostyczne o słabej wybiórczości. Zawartość soli żółci i fioletu krystalicznego hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, które mają duże wymagania odżywcze. Zawartość laktozy jako jedynego cukru pozwala na odróżnienie pałeczek laktozo-dodatnich od laktozo-ujemnych. W obecności zawartego w podłożu wskaźnika – czerwieni obojętnej, wskutek zależnego od rozkładu laktozy zakwaszenia środowiska, kolonie bakterii rozkładających laktozę zabarwiają się na kolor różowy. Kolonie, które aktywnie rozkładają laktozę (np. Escherichia coli), są ponadto otoczone różową strefa wytrąconych soli kwasów żółciowych. Kolonie szczepów rozkładających laktozę słabo lub z opóźnieniem (np. Citrobacter sp.) mogą pozostać bezbarwne lub stają się lekko różowe dopiero po 48 godzinach hodowli. Pałeczki laktozo-ujemne (np. Shigella sp.; Salmonella sp.; Pseudomonas sp.;) mają bezbarwne kolonie. Podłoże hamuje mgławicowy (rozpełzliwy) wzrost  bakterii z rodzaju Proteus np. Proteus mirabilis.

2.4.1. Identyfikacja i wykonanie antybiogramu dla pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae – Escherichia coli.

Wykonanie antybiogramu: met. krążkowo-dyfuzyjna,

E-testy , met. automatyczna

Wykonanie preparatu met. Grama

Test bibułowy – wykrywanie indolu

Rząd biochemiczny lub identyfikacja met. automatyczna karty GNI+

Pałeczka Gram-ujemna z rodziny Enterobacteriaceae – fermentująca laktozę Escherichia coli

2.4.2. Wykonanie preparaty mikroskopowego z kolonii bakteryjnej barwionego metodą Grama (Załacznik 1).

2.4.3. Wykonanie testu bibułowego – wykrywanie indolu.

2.4.4. Wykonanie krótkiego szeregu biochemicznego dla pałeczek z rodzaju Enterobacteriaceae:

2.4.4.1.           Podłoże Kliglera: jest to stałe podłoże diagnostyczne dla pałeczek Gram-ujemnych o małych wymaganiach odżywczych, szczególnie używane w diagnostyce Enterobacteriaceae. Pozwala ono zbadać zdolność rozkładu glukozy, laktozy i wytwarzanie siarkowodoru. Przygotowane jest w probówkach w postaci małych półskosów (rysunki 1, 2, 3,). Podłoże wymaga starannego posiewu zarówno w części słupkowej (wkłucie), jak i skośnej. Proporcja masy podłoża do posianego inokulum w obu częściach jest odwrotna – w części słupkowej przy małym inokulum jest dużo podłoża, a w skośnej odwrotnie. Podłoże zawiera między innymi glukozę i laktozę (w proporcji 1:10), tiosiarczan i jony żelaza, które są wskaźnikiem wytwarzania H2S, oraz wskaźnik pH.

Rozkład glukozy przejawia się zakwaszeniem i zażółceniem wyjściowo łososiowego podłoża. Zmiana postępuje szybciej w części skośnej, gdzie wkrótce pojawia się powrót do barwy wyjściowej, z powodu wtórnej alkalizacji będącej wynikiem rozkładu aminokwasów (skos łososiowy + słupek żółty = rozkład glukozy – schemat III-3). Jeżeli będzie rozkładana laktoza, żółte zabarwienie obu części utrzymuje się przez wiele godzin (skos żółty +  słupek żółty = rozkład laktozy – schemat III-2).

Brak rozkładu cukrów wiąże się z alkalizacją pożywki, która pogłębia swoją wyjściową barwę – przyjmując kolor czerwony – schemat III -1.

Wytwarzanie w czasie fermentacji cukrów dużych ilości CO2 lub H2 uwidacznia się przez rozerwanie lub unoszenie podłoża.

Tworzenie się H2S z tiosiarczanu zachodzi powoli w kwaśnym środowisku słupka i powoduje powstawanie nierozpuszczalnego czarnego strątu siarczku żelaza. Ocena podłoża powinna być dokonana po 24 godzinach.

1.2.3.

Schemat III. Podłoże Kliglera i efekt fermentacji cukrów – 1. - brak frementacji cukrów; 2. - rozkład laktozy; 3. – rozkład glukozy

2.4.4.2 . Rozkład mocznika (wytwarzanie ureazy) – najpopularniejsze podłoże ubogie, podłoże Stuarta – w postaci płynnej. Podłoże to zawiera między innymi mocznik (2%), tryptofan oraz wskaźnik pH – czerwień fenolową . Bakterie posiewa się na podłoże i inkubuje  przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Bakterie wytwarzające enzym ureazę rozkładają mocznik do NH3 i CO2. Powstający w trakcie hodowli NH3 alkalizuje podłoże i powoduje zmianę barwy z żółtej (schemat IV – 1) na różowoamarantową (schemat IV – 2).

Dodanie do podłoża  odczynnika Ehrlicha  w skład, którego wchodzi : p-dimetyloaminobenzaldehyd, alkohol amylowy i stężony kwas solny  - w przypadku reakcj dodatniej powoduje pojawienie się ciemnoamarantowej obrączki na powierzchni podłoża (tryptofan zawarty w podłożu za pośrednictwem tryptofanazy przekształcany jest w indol, skatol i kwas pirogronianowy i NH3.

1. 2. 3.

Schemat IV. Podłoże – rozkład mocznika (wytwarzanie ureazy); 1- brak wytwarzania ureazy, 2-wytwarzanie ureazy, 3- wytwarzanie indolu.

Tabela 2. Wstępna identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych z rodziny Enterobacteriaceae na podstawie wyniku reakcji biochemicznych uzyskanych na podstawie krótkiego szeregu biochemicznego.