Barwienie.doc

BARWIENIE NEGAT-POZYT METODĄ MANEVALA.

Na szkiełko podst. nanosimy 1-2 krople czerwieni Kongo, z podłoża stałego bierzemy mało materiału ezą, wprowadzamy do czerw. , robimy zawiesinę, lekko rozprowadzamy. Suszymy w temp. pokojowej. Na wysuszony preparat nalewamy odczyn Manevala na 1 minutę. Po tym czasie odczynnik zalewamy, nie płuczemy wodą, suszymy i oglądamy pod imersją. Podłoże barwi się na niebiesko, bakterie na czerwono, otoczki są bez bezbarwne.

Barw. met Neisera.

Barwimy tą metodą, aby wykryć maczugowca błonicy. Jeśli są inne maczugowce, nie zobaczymy ziaren wolutyny, bo są charakterys. tylko dla macz. błonicy. Wykonanie: wykonać zawiesinę drobnoustrojów na szkiełko, utrwalić w płomieniu palnika, zmieszać barwnik Neisera I i II w stosunku 2:1, barwienie (zmieszany barwnik Neisera I i II zalewamy na 10 min., spłukujemy wodą, zalewamy chryzoidyną na 10 sekund, bez spłukiwania wodą suszymy w temp. pok., ziarna wolutyny są ciemnogranatowe, kom. żółtobrązowe.

Barw. met. Grama.

Na utrwalony preparat nanosimy fiolet krystaliczny na 2 min. Spłukujemy wodą. Nanosimy płyn Lugola n 1 min. Spłukujemy wodą. Nanosimy alkoh. etyl. na 20 sek. Spłuk. wodą. Zalewamy fuksyną na 15 sek. Spłuk. wodą i suszymy. Oglądamy pod imersją.

Podłoże Chapmana.

Do wzrostu gronkowców, w podłożu tym czynnikiem wybiórczym jest NaCl 6,9% - hamuje wzrost innych drobnoustr., czynnikiem różnicującym jest mannitol (jest fermentowany przez Staphylococcus aurens), dochodzi do zmiany pH i zabarw. z pomarańcz. na żółtą, wskaźnikiem pH jest czerwień fenolowa.

Podłoże MacConkeya.

Do izolacji częściowej, identyfikacji oałeczek z rodziny Euterobacteriacae, czynnikiem wybiórczym jest fiolet krystaliczny, czyn. różnic. jest laktoza, dezoksylan sodu, wskaźnik pH – czerwień obojętna, podłoże endo, sołtysa, Lewina, SS, DC, XLD. 

Wykrywanie rzęsek.

1. Obserwacja wzrostu bakterii na podłożu stałym. Bak. posiadające rzęski charak. tzw.  ruchem pełzającym. 2. Char. wzrostu na podłożu półpłynnym. Wkłuwamy się ezą do wysok. 1/3 słupka. Gdy bakterie dają zmętnienie wzdłuż i poza linią kłucia – mają rzęski. 3. Obserwacja w kropli wiszącej i ciemnym polu widzenia. W technice tej wszystkie bakterie wykazują  ruch. Bak. bez rzęsek wykazują ruchy Browna, kt. spowodowane są uderzeniem cząstek wody o kom. bakterii. Jest to ruch drgający wokół 1 punktu. Jeśli posiadają rzęski, wykazują ruch postępowy. 4. Obserw. w m. . 5. Obserw. w m. świetlnym (srebrzenie). 6. Obserw. w m. kontrast.-fazowym. 7. Metody serologiczne – odczyn aglutynacji obłoczkowej.

Wykrywanie otoczek.

1. Obserw. w m. . 2. Wygląd kolonii na podłożu stałym. Z otoczkami  - kolonie śluzowe. 3. Testy serologiczne – odczyn aglutynacyjny. Aglutynacja pęcznienia otoczek. Odczyny immunofluorescencyjne.4. Barw. neg.-poz. m. Manevala. 

Wykrywanie ziarnistości cytoplazmatycznych.

1. Obserw. w m. . 2. Barw. met. Neisera.

Wykrywanie mikrootoczek.

Obserw. w m. . Barw. met. Grama.

Wykrywanie przetrwalników:

Barwienie wg. Dornera

1. do zawiesiny bakt. w małej probówce dodać taką samą obj. stężonej fuksyny karbolowej; 2. wstawić to do łaźni wodnej i gotować przez 20 min; 3. po tym czasie wyjąć probówkę, wstrząsnąć i 4. ezą przenosimy 1-2 krople na szkiełko podstaw.; 5. do tego 1-2 krople nigrozyny i rozprowadzić na pow. szkiełka;6. suszymy w temp. pokojowej;7. nanosimy olejek imersyjny;8. oglądamy pod 100. Przetrwalniki czerwone; tło czarno-szare; komórki bezbarwne.

Wykrywanie kwasoodpornych prątków

Met. Ziechl – Neelsona

1. na utrwal. preparat umieszczony nad specjalną wanienką  zalewa się fuksynę karbolową;2. barwimy na gorąco, tzn. od spodu podgrz. palnikiem aż fuksyna zacznie parować (do 5 min);3. szkiełko spłukujemy H2O;4. zalewamy odbarwiaczem i odbarwiamy tak długo, aż będzie spływał czysty odbarwiacz (ok. 1 min);5. dobarwiamy rozcieńczonym błękitem metylenowym (2 min);6. barwnik zlewamy;7. płucz. H2O; 8. suszymy w temp. pok;.9. imersja; 10. (100x); prątki kwasoodporne – czerwony; tło na niebiesko

Podłoża dla bakt. beztlenowych:

1.Nieselektywne: TSA (agar tryptozowo-sojowy); agar krwawy (krew królicza 5%); wzbogacone w L-cystynę, wyciąg drożdżowy, wit K1; agar Columba. 2.Selektywne (pozwalają hodować tylko 1 lub 2 rodz. bakt.): KV – kanamycyna i wankomycyna; PV – paramycyna i wankomycyna. 3.Specjalne (nastawione na 1 rodz. lub gat. bakt.): CCFA (cykloseryna, cefloksytyna,fruktoza,agar) – do hodowli Clostidium difficile; BBE – Bacteroides.

SKŁAD CHEM. BAKTERII:

sucha masa 15-30% (70-85 woda), białka 41-65, kw. nukl. 16-18 (DNA 1.8-2.2, mRNA 12-13), polisach. 9-11, lipidy 3-24.

Ściana Gram- :

wielowarstwowa, aminocukry 1-10%, lipidy 10-20, peptydoglikan 10-20. Warstwa zewn. OM wielowarstwowa składa się głównie z LPS (lpopolisacharyd skł. się z 3 warstw: O-PS, czyli O-swoiste polisacharydy; polisacharyd rdzeniowy CA, czyli antygen Kunina; lipid A).

Ściana Gram+ :

jednolita struktura, aminocukry 10-30%, lipidy 0-2 (wyjątki: Corynebacterium, Nocardia, promieniowce tlenowe), peptydoglikan 80-100 zwany mureiną, kwasy teikoiowe (mogą być 2 odmiany: kw. sorbitolowy i rybitolowy); mają one połączenia z lipidami bł. kom. i dlatego nazywane są kw. lipoteikoiwymi (LTA); LTA mogą stanowić cząstki adchezyjne, stąd ważne zjadliwości.

Chem. skł. ściany kom. :

1.Kw. dwuaminowe (L – homoseryna, L – lizyna, kw. L – dwuaminomasłowy, L – ornityna); 2. Pochodne D – glukozy (tylko w ścianie kom. Proc.)

LPS – IMMUNOGENNOŚĆ:

1. jest antygenem grasicozależnym; 2. łańcuch cukrowy – antygen somatyczny O (OPS); 3. większość wytwarzanych przeciwciał (anty – O); 4. determinanty antygenowe decydują o serotypie danego szczepu; 5. w obszarze rdzenia (koło – antygen wspólny) występują 2 determinanty antygenowe; 6. najbogatszą w determinanty antygenowe częścią LPS jest lipid A, w surowicy rzadko są przeciwciała anty-lipidowe; 7. szczepy ze skróconym rdzeniem są bardziej podatne na bateriobójcze działanie lizosomalnych frakcji gramulocytów obojętnochłonnych; 8. w OPS tworzone są przeciwciała anty-LPS (anty – O).

LPS – wł. biolog. :

1. czynnik gorączkotwórczy; 2. może powodować lękopenię, laukocytozę, hiperglikemię, nadciśnienie płucne, wstrząs endotoksyczny, krwawienie, odczyn uogólniony, miejscowy, zgon; 3. LPS bak. jelitowych przedostaje się do krwiobiegu powodując indukcję syntezy przeciwciał przez limfcyty B.