MARKERY NOWOTWOROWE cw.doc

MARKERY NOWOTWOROWE

Test ELISA do oznaczania markerów nowotworowych

Metody immunoenzymatyczne i immunoluminescencyjne najczęściej stosowane metody do oznaczania markerów.

1.                   Metody immunoenzymatyczne (EIA)

·         W metodach EIA wykorzystuje się przeciwciało związane z aktywnym enzymem,

·         Znacznikiem jest peroksydaza chrzanowa (najczęściej), rzadziej fosfataza alkaliczna,             

β-galaktozydaza, oksydaza glukozy, katalaza, ureaza.

·         TMB (tetrametylobenzydyna) lub orto-fenylodiamina (OPD) są substratami dla peroksydazy,

·         Dla fosfatazy substratem jest p-nitrofenylofosforan,

·         Pomiar – detekcja fotometryczna,

·         Chemiluminescencja (immunoluminescencyjne)

Zalety:

·         Wysoka czułość i wysoka swoistość,

·         Nie wymaga kosztownej aparatury,

·         Proste i szybkie w wykonaniu,

·         W porównaniu z radioimmunologicznymi metodami nie wymaga izotopów promieniotwórczych.

Klasyfikacja:

o        Homogenne (reakcja zachodzi w roztworze),

o        Heterogenne (antygen lub przeciwciało związane jest z fazą stałą).

ü      Kompetencyjne (oznaczany antygen współzawodniczy z innym antygenem o miejsce wiązania z przeciwciałem),

ü      Niekompetencyjne  (nie ma współzawodnictwa).

Testy  podział:

a)      W zależności co wykrywają:

·         Antygen,

·         Przeciwciało.

b)      Dzieli się na:

·         Jakościowe,

·         Ilościowe,

·         Półilościowe.

c)       Mogą być:

·         Jednostopniowe,

·         Dwustopniowe.

d)      Klasyfikacja w zależności od konstrukcji, czułości i swoistości testu, wyróżniamy I, II, III, IV generację.4

Test ELISA (odmiana testu immunoenzymatycznego):

·         Test immunoenzymatyczny fazy ciekłej, immunoenzymosorbcyjny,

·         Uzyskuje się większą czułość w porównaniu z metodami bezpośrednimi (aglutynacją).

·         Unieruchomienie antygenu na fazie stałej zwiększa czułość, oraz zastosowanie do detekcji oznakowanych przeciwciał.

·         Czułość metod immunochemicznych:

10-9 – 10-6 g/l,  10-12 – 10-9 g/ml,  pg-ng/ml

Rodzaje testów ELISA:

5 formatów:

1.       Test bezpośredni (1 przeciwciało detekcyjne).

2.       Test pośredni z podwójnym przeciwciałem detekcyjnym.

3.       Tzw. Test „kanapkowy” z przeciwciałem wychwytującym i detekcyjnym.

4.       Test pośredni „kanapkowy” z przeciwciałem wychwytującym i podwójnym detekcyjnym.

5.       Test konkurencyjny (kompetencyjny).

Ad.1  Antygen jest immobilizowany na płytce, dodaje się przeciwciało znakowane, które go wykrywa. Jest prosty i szybki pod warunkiem, że antygen oznaczany jest wcześniej wyizolowany z materiału biologicznego. Może być mało czuły i swoisty jeżeli antygen nie został wyizolowany i inne substancje białkowe będą reagować tak jak antygen. Wtedy stosuje się test podwójny.

Ad.2  Antygen jest immobilizowany na płytce, przeciwciało I generacji reaguje z antygenem, następnie przeciwciało II ze znacznikiem  reaguje z kompleksem antygen przeciwciało I. Bardziej czuły.

Ad.3  Immobilizowane jest przeciwciało wychwytujące, badany antygen jest znakowany enzymem, stosowany jest najczęściej. Bardziej czuły i swoisty niż 2 poprzednie testy.

2 przeciwciała wychwytujące i detekcyjne. Eliminuje to reakcje krzyżowe z innymi antygenami o podobnej budowie, oznaczany antygen nie musi współzawodniczyć o miejsce przyłączania z innym antygenem (przeciwciało wychwytujące jest monoklonalne).

Ad.4  przeciwciało wychwytujące → antygen → przeciwciało I detekcyjne → przeciwciało II detekcyjne z znacznikiem

Ad.5  Istnieje współzawodnictwo

                 Antygen I znakowany

Przeciwciało wychwytujące   

                                                                Antygen II nieznakowany

Współzawodniczenie o miejsce wiązania z przeciwciałem. (oznaczane przeciwciało może też współzawodniczyć z innym przeciwciałem o miejsce wiązania na antygenie).

Zastosowanie testów płytkowych:

1.       Do oznaczania antygenów

2.       Do oznaczania przeciwciał

3.       Do oznaczania haptenów

Ad.1  - testy kanapkowe

Dla: hormonów, markerów nowotworowych, markerów sercowych, białek ostrej fazy, cytokin, cząsteczek adhezyjnych oraz antygenów organizmów patogennych.

Ad.2  - faza stała jest opłaszczona antygenem enzymów patogennych

W diagnostyce chorób infekcyjnych, zakażeniach HIV, HBV, HCV i wirusami grypy.

Ad.3  - testy konkurencyjne

Dla: hormonów tarczycy, hormonów steroidowych, leków, metabolitów leków, narkotyków (kontrola dopingowa – jakościowo i ilościowo).

Zasada metody ELISA (oznaczenie CEA)

·         Wykonuje się na mikropłytce z 96 dołkami,

·         1 reakcja immunologiczna – do przeciwciał związanych z mikroprobówkami dodajemy antygen z materiału badanego (osocze, surowica). Powstaje na fazie stałej kompleks przeciwciało (wychwytujące) – antygen.

·         2 reakcja immunologiczna – dodajemy przeciwciało znakowane enzymem przeciwko CEA (znakowane peroksydazą chrzanową). Powstaje kompleks przeciwciało –antygen – przeciwciało znakowane enzymem.

·         Odpłukanie niezwiązanych przeciwciał znakowanych enzymem.

·         Reakcja wskaźnikowa – barwna, dodajemy substrat dla enzymu (tetrametylobenzydynę).

·         Zatrzymanie reakcji barwnej przez zakwaszenie środowiska (HCl lub H2SO4) – 1N HCl u nas. Tetrametylobenzydyna djae niebieskie zabarwienie, po zakwaszeniu powstaje żółte.

·         Mierzy się intensywność zabarwienia za pomocą czytnika mikropłytek, przy odpowiedniej długości fali λ=450nm MULTISKAN

·         Obliczanie stężenia badanego antygenu na podstawie krzywej kalibracyjnej, z wykorzystaniem programu komputerowego GENESIS przy odpowiedniej metodzie statystycznej (4 parametrowa funkcja logistyczna lub cubic spline).

CEA - ELISA  - zestaw odczynników IBL (RE 591 01)