RakKrtani_apoptoza_i_proliferacja.pdf

Gryczyñski M., Wioletta Pietruszewska W.: Wybrane aspekty apoptozy i proliferacji komórkowej raka krtani

CHOROB Y JAMY USTNEJ, GARD£

Y JAMY USTNEJ, GARD£ A I KRT

Otorynolaryngologia, 2002, 1(1), 1-11

A I KRT ANI

ANI

151

Otorynolaryngologia, 2002, 1(3), 151-160

ybrane aspekty apoptozy i proliferacji komórkowej

raka krtani

The selected aspects of apoptosis and cell proliferation of laryngeal cancer

yngeal cancer

M ACIEJ G RYCZYÑSKI , W IOLETTA P IETRUSZEWSKA

Katedra Otolaryngologii i Klinika Laryngologii Uniwersytetu Medycznego, ul. Kopciñskiego 22, 90-153 £ódŸ

Mimo rozwoju metod diagnostycznych i leczniczych rak krtani nadal po-

zostaje istotnym problemem onkologicznym. Do czynników o uznanym zna-

czeniu rokowniczym u chorych na raka krtani nale¿¹ m.in. klasyfikacja TNM

i stopieñ zró¿nicowania histologicznego nowotworu. WskaŸniki te czêsto nie

s¹ wystarczaj¹ce w diagnozowaniu, monitorowaniu przebiegu choroby,

prognozowaniu czasu prze¿ycia chorych i zawodz¹ przy podejmowaniu

decyzji o rozleg³oœci zabiegu chirurgicznego (zw³aszcza wêz³ów ch³onnych

szyi), jak równie¿ dodatkowego napromieniania lub chemioterapii. Badania

ostatnich lat podnosz¹ prognostyczne znaczenie oceny biologii nowotwo-

rów i zwi¹zanych z ni¹ procesów proliferacji komórkowej i apoptozy. Aktyw-

noœæ proliferacyjna nowotworu zwi¹zana jest z szybkoœci¹ jego wzrostu,

a okreœlenie wielkoœci frakcji wzrostowej jest uznanym wskaŸnikiem w pro-

gnozowaniu czasu prze¿ycia chorych na ró¿ne nowotwory. Apoptoza jest

ci¹giem zdarzeñ morfologicznych, biochemicznych i molekularnych prowa-

dz¹cych do œmierci komórki, a kluczow¹ rolê w jej regulacji odgrywaj¹ bia³ka

P53 i Bcl2. W pracy omówiono podstawowe pojêcia dotycz¹ce apoptozy

i proliferacji komórkowej, opisano morfologiczne i biochemiczne cechy ko-

mórki apoptotycznej oraz geny i bia³ka P53, Bcl2 i Ki67. W oparciu o w³asne

doœwiadczenie wskazano na prognostyczn¹ wartoœæ oceny ekspresji po-

wy¿szych genów i bia³ek u chorych na raka krtani. Podkreœlono równie¿

zale¿noœci miêdzy procesami apoptozy i proliferacji w raku krtani a mo¿liwo-

œci wykorzystania oceny tych procesów w diagnozowaniu, leczeniu i moni-

torowaniu chorych na raka krtani oraz na inne z³oœliwe nowotwory lite.

Otorynolaryngologia, 2002, 1(3), 151-160

Despite of constant progress of diagnostic and treatment methods

laryngeal cancer is still essential oncological problem. TNM classification and

histological grading are the recognised prognostic factors in patients with

laryngeal cancer. They are often not satisfactory in diagnosing, monitoring

and prognosis of survival in individual patient. They also mislead in making

decision on the range of the operation (particularly type of lymphadenecto-

my) and additional treatment (radiotherapy and chemotherapy). The recent

research studies are focused on the prognostic value of some biological

features and processes in tumours cells and the relation to proliferation and

apoptosis. As the tumour proliferation seems to be associated with tumour

growth, the evaluation of the growth fraction is recognised as prognostic

factor in patients with various cancers. The apoptosis is another chain of

morphological, biochemical and molecular reactions leading to the cell death

with current key role of p53 and Bcl2 proteins. The authors indicated

prognostic value of these protein expression in patients with laryngeal

cancer and also emphasized relations between discussed processes of apop-

tosis and proliferation and their application in diagnosing, treatment and

follow-up of the patients with laryngeal cancer and other solid tumours.

Otorynolaryngologia, 2002, 1(3), 151-160

Key words: laryngeal cance, apoptosis, cell proliferation, prognostic factor

S³owa kluczowe: rak krtani, apoptoza, proliferacja komórkowa, czynnik

rokowniczy

Mimo ci¹g³ego udoskonalania metod diagnostycz-

nych i leczniczych rak krtani nadal pozostaje istotnym

problemem onkologicznym. Do czynników o uznanym

znaczeniu rokowniczym u chorych na raka krtani nale¿¹

m.in. klasyfikacja TNM zaakceptowana przez Komitet

Miêdzynarodowej Unii do Walki z Rakiem [1] i oparte

na niej stopnie zaawansowania choroby oraz stopieñ zró¿-

nicowania histologicznego nowotworu [2]. WskaŸniki

te czêsto nie s¹ wystarczaj¹ce w diagnozowaniu, monito-

rowaniu przebiegu choroby i prognozowaniu czasu prze-

¿ycia chorych. Klasyczne czynniki rokownicze czêsto rów-

nie¿ zawodz¹ w podejmowaniu decyzji o rozleg³oœci za-

biegu chirurgicznego, a zw³aszcza operacji wêz³ów ch³on-

nych szyi i koniecznoœci podjêcia dodatkowego napromie-

niania lub chemioterapii. Uzasadnione s¹ wiêc poszuki-

wania niezale¿nych wskaŸników prognostycznych, które

u³atwia³yby wybór tego postêpowania. W ostatnich la-

tach w badaniach nad nowotworami wzros³o zaintereso-

wanie apoptoz¹ oraz zaburzeniami przebiegu cyklu ko-

mórkowego jako istotnymi czynnikami przyczyniaj¹cy-

mi siê do powstawania i rozwoju nowotworów. Uwa¿a

siê, ¿e pojawienie siê i rozprzestrzenianie nowotworu to

nie tylko nagromadzenie w komórkach zmian genetycz-

nych powsta³ych w konsekwencji nadekspresji, wzglêdnie

CHOROB

Y JAMY USTNEJ, GARD£

A I KRT

ANI

Wybrane aspekty apoptozy i proliferacji komórkowej

ybrane aspekty apoptozy i proliferacji komórkowej

The selected aspects of apoptosis and cell proliferation of lar

Key words:

S³owa kluczowe:

152

Otorynolaryngologia, 2002, 1(3), 151-160

mutacji, protoonkogenów lub utraty, b¹dŸ zmian, genów

supresorowych transformacji nowotworowej. Równie

istotnym czynnikiem w procesie nowotworowym jest

obni¿enie zdolnoœci komórek do prawid³owego umiera-

nia, tj. apoptozy, jako odpowiedzi na bodŸce pochodz¹ce

ze œrodowiska otaczaj¹cego komórkê. Doprowadziæ to

mo¿e do nieprawid³owego zwiêkszenia ¿ywotnoœci i wy-

d³u¿enia ¿ycia komórek oraz utrwalania ju¿ zaistnia³ych

mutacji, a tak¿e do wyst¹pienia zaburzeñ cyklu komór-

kowego. Z drugiej strony wady w kontroli cyklu komór-

kowego s¹ jedn¹ z najwa¿niejszych przyczyn procesu

nowotworzenia. Przywracanie sprawnego nadzoru nad

cyklem komórkowym mo¿e przyczyniæ siê do pozytyw-

nych rezultatów w leczeniu nowotworów.

minacja niedojrza³ych limfocytów T i B). Tego rodzaju

proces warunkuje prawid³owy rozwój i funkcjonowanie

organizmu, a tak¹ apoptozê nazywa siê zaprogramowan¹

rozwojowo.

Kolejny rodzaj to zaprogramowana œmieræ komórki

w odpowiedzi na bezpoœrednie dzia³anie czynników bio-

chemicznych lub fizycznych (promieniowanie jonizuj¹-

ce) i stanowi obecnie przedmiot badañ naukowych

[9,10,11,12].

Zbli¿ony do powy¿szego rodzaj apoptozy towarzy-

szy obumieraniu komórek w rozwoju nowotworów lub

w okresie regresji hiperplastycznych organów lub tkanek.

Wówczas jest ona wywo³ana samym procesem patolo-

gicznym, a nie odpowiedzi¹ na czynnik powoduj¹cy dany

stan. Mówi¹c inaczej nowotwór, a nie karcynogen sty-

muluje rozwój tego procesu. Rola apoptozy w powstawa-

niu nowotworów nie jest do koñca okreœlona. Wystêpo-

wanie tego zjawiska w obrêbie guza mo¿e powodowaæ

utratê nieœmiertelnoœci komórek raka, a tym samym unie-

mo¿liwiaæ rozwój nowotworu. Apoptoza mo¿e zarówno

hamowaæ rozwój komórek nowotworowych, jak równie¿

stymulowaæ ich klonowy rozwój poprzez eliminacjê s¹-

siaduj¹cych komórek.

Apoptoza – zaprogramowana œmieræ komórki

Wyró¿nia siê dwa g³ówne mechanizmy œmierci ko-

mórek, tj. martwicê i apoptozê, które istotnie ró¿ni¹ siê

biochemicznie i morfologicznie. Martwica jest procesem

biernym i przypadkowym, wywo³ywanym przez zmiany

w otoczeniu komórki, takie jak niedokrwienie, gwa³tow-

ne zmiany temperatury lub uraz mechaniczny, które po-

woduj¹ nieodwracalne uszkodzenia uporz¹dkowanej

struktury komórkowej. W samych komórkach wystêpu-

j¹ wczesne zaburzenia w funkcji mitochondriów i b³on

komórkowych, co prowadzi do zmian regulacji ciœnienia

osmotycznego, zwiêkszenia objêtoœci komórek, a w koñ-

cowym etapie – ich rozpadu i œmierci. W wyniku mar-

twicy zawartoœæ umieraj¹cych komórek (np.: enzymy pro-

teolityczne) zostaje uwolniona do przestrzeni pozakomór-

kowej, co wywo³uje lub zwiêksza miejscowy stan zapalny

przyczyniaj¹c siê do uszkodzenia s¹siednich komórek i

tkanek [3,4].

Okreœlenie apoptoza zosta³o wprowadzone w 1972 r.

[5] i pochodzi z jêz yka greckiego, a oznacza opadanie

p³atków z kielicha kwiatów lub liœci z drzew. Synonimy

apoptozy to „samobójcza”, aktywna, fizjologiczna lub

nieprzypadkowa œmieræ komórki, martwica „obkurcze-

niowa”, a tak¿e programowana œmieræ komórki (ang. pro-

grammed cell death). Jest ona procesem czynnym, uwa-

runkowanym genetycznie, przeciwstawnym mitozie i ró¿-

nym od martwicy. Stanowi ci¹g zdarzeñ morfologicznych,

biochemicznych i molekularnych, które w konsekwencji

prowadz¹ do œmierci komórki. Zapocz¹tkowanie apop-

tozy wymaga aktywacji wielu genów m.in. p-53, mdm2,

bcl-xS, bax i hamowania ekspresji innych np. bcl-2, bcl-

xL [3,4,6-8]. Ma ona podstawowe znaczenie w embrio-

genezie (np. obumieranie przewodu Müllera u embrio-

nów p³ci mêskiej), w przebiegu inwolucji narz¹dów (ob-

umieranie tymocytów w okresie rozwoju osobniczego),

w procesach odnowy i regeneracji tkanek oraz w zakoñ-

czeniu ¿ycia komórek zró¿nicowanych (apoptoza leuko-

cytów, komórek nab³onka skóry lub jelit, komórek en-

dometrium w okresie poprzedzaj¹cym menstruacjê, eli-

Cechy morfologiczne i biochemiczne komórki

apoptotycznej

Morfologia komórki gin¹cej z powodu apoptozy

znacznie siê ró¿ni od obrazu komórki nekrotycznej. Pro-

ces programowanej œmierci rozpoczyna siê w j¹drze ko-

mórkowym, w którym dochodzi do kondensacji i agre-

gacji chromatyny, a tym samym do zmniejszenia objêto-

œci j¹dra. Sprawia ono wra¿enie zapadniêtego i skurczo-

nego, przy zachowanej integralnoœci b³on i czynnoœci

organelli. W nastêpnym etapie, z powodu utraty wody,

dochodzi do zmniejszenia objêtoœci ca³ej komórki, na-

wet do ok. 30-50%. W koñcowej fazie apoptozy ulega ona

fragmentacji i powstaj¹ otoczone b³on¹ komórkow¹ kwa-

soch³onne cz¹steczki zwane cia³kami apoptotycznymi (ang.

apoptotic body) zbudowane z czêœci zagêszczonej chro-

matyny, organelli i cytozolu. [4,13]. Komórki i cia³ka apop-

totyczne s¹ usuwane z tkanek w procesie fagocytozy, w któ-

rym istotn¹ rolê odgrywa obecnoœæ receptora witronekty-

nowego na b³onie komórkowej makrofagów [3,14]. Apop-

totyczna œmieræ komórek oraz ich fagocytoza nie powo-

duj¹ uwolnienia enzymów proteolitycznych, nie towarzy-

szy wiêc jej reakcja zapalna, a œmieræ poszczególnych ko-

mórek nie wywo³uje rozleg³ej destrukcji tkanek.

Programowana œmieræ komórki jako proces aktywny

wymaga dostarczenia energii i charakteryzuje siê wzmo-

¿on¹ syntez¹ RNA i bia³ek, jak równie¿ pobudzeniem

czynnoœci enzymów komórkowych. W wyniku pobudze-

nia endonukleaz (NUC 18, DNAzy I, DNAzy II) kata-

lizuj¹cych rozerwanie wi¹zañ wewn¹trznukleosomalnych,

dochodzi do fragmentacji DNA na odcinki bêd¹ce

Gryczyñski M., Wioletta Pietruszewska W.: Wybrane aspekty apoptozy i proliferacji komórkowej raka krtani

153

wielokrotnoœci¹ nukleosomów (180-200 par zasad), sta-

nowi¹cej prawdopodobnie pierwszy, nieodwracalny etap

apoptozy. W procesie apoptozy stwierdzono tak¿e wzrost

aktywnoœci topoizomeraz (topo I i topo II – generuj¹ jed-

no- lub dwuniciowe pêkniêcia w helisie DNA), enzy-

mów proteolitycznych (umo¿liwiaj¹ przemianê nieczyn-

nych form prekursorowych endonukleaz w aktywne),

transglutaminaz tkankowych (powoduj¹ powstawanie

wi¹zañ miêdzy bia³kami cytoplazmatycznymi, co prowa-

dzi do kurczenia siê komórek i zmiany ich kszta³tu) oraz

enzymów: gamma-glutamylo-transpeptydazy, rybonukle-

azy i aktywatora plazminogenu. Cech¹ charakterystycz-

n¹ w wiêkszoœci komórek indukowanych do apoptozy jest

tak¿e wzrost stê¿enia jonów wapniowych w cytozolu ko-

mórkowym, bêd¹cych aktywatorami zarówno endonu-

kleaz jak i transglutaminaz tkankowych niezbêdnych

podczas tworzenia cia³ek apoptotycznych [3,8,14-16].

Do wykrywania apoptozy stosuje siê m.in.: obserwa-

cjê mikroskopow¹ zmian morfologii komórek, znakowa-

nie komórek barwnikami (w tym fluorochromami), test

przepuszczalnoœci b³ony komórkowej, rejestracjê zmian

w budowie b³ony komórkowej (translokacja fosfatydylo-

seryny), pomiar aktywnoœci kaspazy 3, wykrywanie in situ

fragmentacji DNA (ISEL – ang. in situ end labeling),

cytofotometriê przep³ywow¹; technikê ISNT (ang. in situ

nick translation, wykorzystuj¹ca DNA polimerazê I) lub

technikê TUNEL (ang. terminal deoxynucleotidyl trans-

ferase-mediated dUTP nick endlabeling, wykorzystuj¹-

c¹ terminaln¹ transferazê) [13,15,17,18]. Najlepsz¹ me-

tod¹ jest jakoœciowa ocena ultrastruktury komórki [13].

Poœredni¹ ocen¹ apoptozy jest analiza ekspresji genów

i ich produktów bior¹cych udzia³ w jej regulacji.

Proces apoptozy mo¿e byæ m.in. wywo³any przez:

hormony tarczycy i glikokortykosteroidy, cytokiny (TNF

– czynnik martwicy nowotworu), deficyt czynników wzro-

stowych i troficznych, czynniki cytotoksyczne (granzy-

my A i B, etopozyd, mitoksantron, difluorometyloorni-

tyna, antracykliny) i czynniki fizyczne (promieniowanie

jonizuj¹ce, hipertermia, ciœnienie hydrodynamiczne).

Mechanizmy apoptozy i jej znaczenie w regulacji sze-

regu fizjologicznych i patologicznych procesów komór-

kowych znajduj¹ siê w obszarze zainteresowania wspó³-

czesnej nauki. Badania te maj¹ bardzo istotne znaczenie

dla lepszego zrozumienia biologii komórki oraz rozwoju

i przebiegu wielu stanów chorobowych [19,20]. Genowa

regulacja stanu dynamicznej równowagi miêdzy podat-

noœci¹ i opornoœci¹ na apoptozê ma zasadnicze znacze-

nie dla wyjaœnienia dynamiki wzrostu zarówno komórek

prawid³owych jak i nowotworowych. Apoptoza zapew-

nia usuwanie z organizmu komórek z defektami gene-

tycznymi, zatem nastêpstwem jej zahamowania mo¿e byæ

proliferacja klonu komórek nieprawid³owych. Przyczyn¹

wzrostu nowotworu mo¿e byæ nie tylko zwiêkszona pro-

liferacja komórek, ale równie¿ wyd³u¿enie czasu ich prze-

¿ycia na skutek upoœledzenia procesów apoptozy. Za istot-

nym znaczeniem tego zjawiska przemawia obserwacja,

¿e wiele genów reguluj¹cych apoptozê wykazuje zabu-

rzenia ekspresji w procesach nowotworowych, a kluczo-

w¹ rolê w regulacji apoptozy odgrywaj¹ produkty bia³ko-

we genu P53 i Bcl2 [8,19-22,24,25].

Gen i bia³ko P53

Gen P53 nale¿y do genów supresorowych transfor-

macji nowotworowej (antyonkogenów), czyli tych, któ-

rych bia³kowe produkty hamuj¹ powstawanie fenotypu

nowotworowego [26]. Jest on zlokalizowany w chromo-

somie 17p13.1 i sk³ada siê z 11 eksonów [22,27]. W ge-

nomie wystêpuje w pojedynczej kopii. Produktem genu

jest bia³ko o masie 53 kD (st¹d nazwa genu i bia³ka),

które sk³ada siê z 393 aminokwasów. Prawid³owe bia³ko

P53 jest kluczowym negatywnym regulatorem cyklu ko-

mórkowego, a jego rola sprowadza siê przede wszystkim

do kontroli integralnoœci genomu, st¹d czêsto stosowane

jest dla niego okreœlane „stra¿nik genomu”. Udzia³ bia³-

ka P53 w transkrypcji genów, w regulacji cyklu komór-

kowego, kontroli naprawy DNA, inicjacji apoptozy i naj-

prawdopodobniej angiogenezy powoduje, ¿e jest ono nie-

zbêdne dla zachowania prawid³owych czynnoœci komórki

[14,24,27-30]. Aktywnoœæ biologiczna bia³ka P53 zale-

¿y od stopnia jego fosforylacji, a jego aktywn¹ form¹ jest

ufosforylowany homotetramer, tzw. „dzikie bia³ko” (bia³-

ko niezmutowane). Rozpoznaje ono œciœle okreœlone se-

kwencje DNA, dzia³aj¹c jak czynnik transkrypcyjny dla

niektórych genów jak: WAF1, gadd45 (ang. growth ar-

rest DNA damage inducible), RB1 (gen siatkówczaka

z³oœliwego), cykliny G oraz TSP-1 (trombospondyna 1)

[25,31]. Obecnoœæ uszkodzeñ DNA (indukowanych

m.in. przez czynniki fizyczne, chemiczne lub genotok-

syczne czynniki œrodowiskowe) powoduje akumulacjê

prawid³owego bia³ka P53 w j¹drze komórkowym i za-

blokowanie cyklu komórkowego w fazie G1, wyd³u¿aj¹c

tym samym czas na ich reperacjê przed wejœciem w fazê

S [24, 28]. Zatrzymanie cyklu w tej fazie odbywa siê na

drodze aktywacji transkrypcji genu WAF1/CIP1, który

koduje bia³ko o ciê¿arze cz¹steczkowym 21 kD (tzw. bia³-

ko P21). Ma ono zdolnoœæ hamowania aktywnoœci grupy

kinaz fosforyluj¹cych cykliny (cdk, ang. cyclin dependent

kinase), niezbêdnych do przejœcia komórki w fazê repli-

kacji DNA (faza S). Ponadto bia³ko P21, ³¹cz¹c siê z

podjednostk¹ polimerazy DNA o nazwie PCNA (ang.

proliferating cell nuclear antigen) hamuje jej dzia³anie,

wp³ywaj¹c bezpoœrednio na replikacjê [32]. Bia³ko P53

pobudza mechanizm reperacji uszkodzonego DNA.

Z jednej strony przypuszcza siê, ¿e dzia³a ono jako czyn-

nik transkrypcyjny z DNA, aktywuj¹c nie tylko gen ko-

duj¹cy bia³ko P21, ale tak¿e gen gadd45, którego pro-

duktem jest bia³ko blokuj¹ce wejœcie komórek w fazê S

i jednoczeœnie stymuluj¹ce szybkoœæ naprawy DNA (wy-

cinanie uszkodzonych fragmentów DNA) [32]. Z dru-

154

Otorynolaryngologia, 2002, 1(3), 151-160

giej strony bia³ko P53 oddzia³ywuje jako represor trans-

krypcji genów niezbêdnych do przebiegu cyklu komór-

kowego. To dwukierunkowe dzia³anie powoduje odwra-

calne zablokowanie tego cyklu, co u³atwia naprawê DNA,

wyd³u¿aj¹c czas, jaki komórki maj¹ na usuniêcie uszko-

dzeñ, zanim nast¹pi powielenie i podzia³ materia³u ge-

netycznego. Udzia³ bia³ka P53 w kontroli naprawy DNA

polega na modulowaniu aktywnoœci helikaz (enzymy usu-

waj¹ce uszkodzenia DNA), a w przypadku, gdy repera-

cja DNA zawodzi, bia³ko P53 uruchamia proces progra-

mowanej œmierci komórki (dlatego gen P53 okreœlany jest

czêsto jako gen „ku œmierci”) [8,22-25]. Bia³ko P53

uczestnicz¹c w mechanizmach reparacji DNA oraz in-

dukcji apoptozy, mo¿e istotnie wp³ywaæ na wra¿liwoœæ

komórek na chemioterapeutyki i promieniowanie joni-

zuj¹ce [33,34].

Mechanizmy indukcji apoptozy przez bia³ko P53

nadal nie s¹ do koñca wyjaœnione. Uwa¿a siê, ¿e w odpo-

wiedzi na sygna³ apoptotyczny bia³ko P53 aktywuje trans-

krypcjê wielu genów koduj¹cych, m.in. bia³ka Bax, PIG3,

Fas (Apo1), DR5 (Apo2) i IGF-BP3. Bia³ko P53 indu-

kuje apoptozê równie¿ poprzez hamowanie ekspresji genu

bcl2 (inhibitor apoptozy) lub w sposób niezale¿ny od

transkrypcji genów [8,21,24,34].

Prawid³owe bia³ko P53 ma okres pó³trwania 10-20

minut, natomiast bia³ko zmutowane przebywa w komórce

do 12 godzin i dziêki temu mo¿e byæ wykrywane meto-

dami IHC. Mutacje w genie p53 s¹ najczêstszym defek-

tem genetycznym stwierdzanym w nowotworach wszyst-

kich typów u ludzi, a do tej pory opisano ich ponad tysi¹c

[11,35]. G³ównie s¹ to mutacje punktowe zmian sensu

(powoduj¹ce redukcjê funkcjonalnych tetramerów bia³ka),

insercje i mutacje nonsensowe lub delecja niezmutowa-

nego allelu p53, a ró¿nice w aktywnoœci biologicznej

zmienionych form bia³ka zale¿¹ od rodzaju i miejsca

mutacji [35,36]. Zmutowane bia³ko nie traci zdolnoœci

do tworzenia tetrameru z prawid³owym bia³kiem P53,

ale nie ma ju¿ mo¿liwoœci specyficznego wi¹zania siê

z DNA, przez co nie pe³ni roli regulatora transkrypcji.

Stwierdzono, ¿e nowotwory ró¿ni¹ siê spektrum muta-

cyjnym genu p53, co mo¿e wynikaæ z ekspozycji na od-

mienne karcynogeny [35].

Do zmiany aktywnoœci funkcjonalnej „dzikiego bia³-

ka” P53 mo¿e tak¿e dochodziæ na skutek jego wi¹zania

siê z produktami wirusów onkogennych (powsta³y hete-

rodimer równie¿ nie jest aktywny jako regulator trans-

krypcji), a tak¿e w wyniku wzmocnionej ekspresji genu

mdm2, którego produkt jest inhibitorem bia³ka P53.

Konsekwencj¹ braku prawid³owo funkcjonuj¹cego bia³-

ka P53 jest zniesienie jego wp³ywu na proces apoptozy,

utrata kontroli nad podzia³ami komórki i napraw¹ uszko-

dzeñ DNA, prowadz¹ca do gromadzenia siê mutacji oraz

aberracji chromosomowych i w nastêpstwie – szybka se-

lekcja komórek o fenotypie nowotworowym, czyli trans-

formacja nowotworowa [8,28,37]. Mimo, ¿e rola bia³ka

P53 w procesie apoptozy nie jest do koñca poznana, obec-

noœæ prawid³owej jego formy jest niezbêdna dla przebie-

gu programowanej œmierci komórki wywo³anej czynni-

kami uszkadzaj¹cymi DNA. Stwierdzono równie¿ wp³yw

genu P53 i jego bia³ka na proces angiogenezy nowotwo-

rowej. Pojawienie siê fenotypu angiogennego w komór-

kach nowotworowych ma byæ zwi¹zane z wyst¹pieniem

mutacji w genie P53. Znosz¹ one wielokierunkow¹ ak-

tywnoœæ supresyjn¹ genu P53 i prowadz¹ m.in. do uak-

tywnienia genu VEGF, który uwa¿any jest za jeden z naj-

silniejszych mitogenów komórek œródb³onka [38-40].

Czynnik ten z kolei aktywuje równie¿ szereg innych ge-

nów bior¹cych udzia³ w neowaskularyzacji, co sprzyja

utrwalaniu siê fenotypu angiogennego w komórkach no-

wotworowych i ci¹g³ej, niepohamowanej stymulacji an-

giogenezy w guzie. W badaniach doœwiadczalnych stwier-

dzono, ¿e wprowadzenie do komórek nowotworowych

Ryc. 1. Ekspresja bia³ka P53 widoczna w wiêkszoœci komórek raka krtani

(odczyn immunoperoksydazowy; pow. 100x)

Ryc. 2. Ekspresja bia³ka P53 widoczna w wiêkszoœci komórek raka krtani pod

postaci¹ drobnych ziaren w j¹drach (odczyn immunoperoksydazowy, powiêk-

szenie 400x)

Gryczyñski M., Wioletta Pietruszewska W.: Wybrane aspekty apoptozy i proliferacji komórkowej raka krtani

155

prawid³owego genu P53 znosi aktywnoœæ genu VEGF,

poniewa¿ prawid³owe bia³ko P53 jest represorem trans-

krypcji tego genu [41]. Proces angiogenezy jest w orga-

nizmie stale hamowany przez trombospondynê-1, wie-

lofunkcyjn¹ glikoproteinê wystêpuj¹c¹ w macierzy poza-

komórkowej i hamuj¹c¹ proliferacje i migracje komórek

œródb³onka naczyñ. Wydaje siê, ¿e jej synteza jest regu-

lowana przez bia³ko P53. W przypadku, gdy stê¿enie bia³-

ka P53 zmniejsza siê, iloœæ trombospondyny równie¿ ma-

leje, co stymuluje podzia³y komórek œródb³onka naczyñ

krwionoœnych s¹siaduj¹cych z nowotworem i pobudza eks-

presjê genów, których produkty (np.: hormony, czynniki

wzrostu i interferony) u³atwiaj¹ komórkom guza szybki

wzrost i tworzenie nacieków inwazyjnych [40].

W badaniach w³asnych (praca w druku) ekspresjê bia-

³ka P53 stwierdzono u 117 chorych na raka krtani

(77,48%) (ryc. 1, ryc. 2).

Zaobserwowano znamienne zale¿noœci miêdzy

zwiêkszon¹ ekspresj¹ tego bia³ka a wielkoœci¹ guza pier-

wotnego (p=0,01) i wystêpowaniem wznowy miejscowej

(p=0,003), a zale¿noœæ z obecnymi przerzutami w wê-

z³ach ch³onnych by³a bliska istotnoœci (p=0,05). Zarówno

ca³kowity, jak i wolny od choroby, czas prze¿ycia by³ zna-

miennie krótszy u chorych z wysok¹ ekspresj¹ bia³ka P53.

nab³onkowe wra¿liwe na bodŸce hormonalne) [20,44,45].

Fizjologiczna rola tego bia³ka polega na hamowaniu apop-

tozy, co w komórkach niezró¿nicowanych umo¿liwia pra-

wid³owy przebieg morfogenezy oraz procesów ró¿nico-

wania, natomiast w komórkach ju¿ zró¿nicowanych po-

zwala na ich odpowiednio d³ugie prze¿ycie [20]. Bia³ko

Bcl2 uczestniczy w hamowaniu apoptozy towarzysz¹cej

zarówno procesom fizjologicznym jak i nowotworowym

[19,20]. Zwiêkszon¹ ekspresjê tego bia³ka wykrywa siê

zarówno w niektórych procesach rozrostowych uk³adu

ch³onnego, jak i w innych nowotworach [10,12]. Me-

chanizmy dzia³ania bia³ka Bcl2 nie s¹ do koñca wy-

jaœnione. Udowodniono, ¿e mo¿e ono podejmowaæ dzia-

³anie w dowolnej fazie cyklu komórkowego i nie posiada

wp³ywu na proliferacjê [20]. Sugeruje siê mo¿liwoœæ in-

gerencji tego bia³ka w rozmieszczenie i zmianê stê¿enia

jonów wapnia, wp³yw na aktywnoœæ i dystr ybucjê endo-

nukleaz lub kinaz fosforyluj¹cych cykliny [20,43], a efekt

antyapoptotyczny osi¹ga ono najprawdopodobniej po-

przez hamowanie produkcji wolnych rodników i/lub

wp³yw na redystrybucjê jonów wapniowych w komórce

lub na zachowanie integralnoœci b³ony mitochondrialnej

i zapobieganie uwalnianiu cytochromu c. Stwierdzono,

¿e bia³ko P53 reguluje ekspresjê genów Bcl2 i Bax, a apop-

toza indukowana przez prawid³owe bia³ko P53 jest przy-

najmniej czêœciowo zwi¹zana z hamowaniem ekspresji

genu Bcl2 i pobudzaniem ekspresji genu Bax [20]. Wy-

daje siê, ¿e zmutowana forma bia³ka P53 mo¿e zacho-

waæ hamuj¹cy wp³yw na ekspresjê Bcl2, ale jednoczeœnie

sama mo¿e dzia³aæ jako supresor programowanej œmierci

komórki [20,45]. Bia³ko Bcl2 mo¿e jednak oddzia³ywaæ

na apoptozê tak¿e na drodze niezale¿nej od P53.

Uwa¿a siê, ¿e spoœród wszystkich znanych bia³ek,

Bcl2 jest najsilniejszym inhibitorem apoptozy wywo³a-

nej przez ró¿ne czynniki (glikokortykosteroidy, chemio-

terapeutyki, hipertermia, deficyt czynników wzrostowych

lub promieniowanie jonizuj¹ce) [4,10,12].

W procesach nowotworowych nadekspresja bia³ka

Bcl2 mo¿e powodowaæ opornoœæ nowotworów na che-

mio- i radioterapiê przez hamowanie procesu apoptozy

w komórkach guza [10,12].

W badaniach w³asnych (praca w druku) ekspresjê bia-

³ka Bcl2 stwierdzono u 68 chorych (45,0%) na raka krta-

ni (ryc. 3, ryc. 4).

Nie zaobserwowano istotnych zale¿noœci miêdzy eks-

presj¹ tego bia³ka a cechami klinicznymi i histologiczny-

mi nowotworu oraz czasem prze¿ycia chorych (p>0,05),

poza wysoce znamienn¹ zale¿noœci¹ miêdzy dodatni¹

ekspresj¹ bia³ka Bcl2 a obecnoœci¹ wznów miejscowych

(p<0,001). Nale¿y zastanowiæ siê nad przydatnoœci¹ ba-

dania ekspresji bia³ka Bcl2 w raku krtani. Wykazano bo-

wiem, ¿e bia³ko Bcl2 ma hamuj¹cy wp³yw na proces apop-

tozy bêd¹cej wynikiem chemioterapii lub napromienia-

nia [46,47]. Ocena ekspresji tego bia³ka mo¿e pomóc

w selekcji tych nowotworów, które s¹ potencjalnie oporne

Gen i bia³ko Bcl2

Gen Bcl2 nale¿y do protoonkogenów, których uszko-

dzenie objawia siê niekontrolowanym wzrostem ich ak-

tywnoœci lub ekspresji, co prowadzi do powstania nowo-

tworu. Zosta³ on wykryty w wyniku translokacji chro-

mosomowej t [14,18] stwierdzonej w ch³oniaku limfo-

cytów B (ang. B Cell Lymphoma) [42]. Gen Bcl2 nale¿y

do rodziny Bcl2, do której zalicza siê geny pobudzaj¹ce

apoptozê (jak Bax, Bad, Bcl-Xs, Bak) i hamuj¹ce j¹ (m.in.

Bcl-2, Bcl-X, Bcl-w, Brag-1, Mcl-1). Wszystkie one maj¹

dwie konserwatywne ewolucyjnie domeny: BH1 i BH2

uczestnicz¹ce w oddzia³ywaniach miêdzy poszczególny-

mi cz³onkami rodziny. Ich bia³kowe produkty ³¹cz¹ siê

w homo- lub heterodimery (np. Bcl2-Bcl2, Bax-Bcl2,

Bax-Bax). Stwierdzono, ¿e przewaga homodimerów Bcl-

2 decyduje o prze¿yciu, podczas gdy przewaga Bax –

o œmierci komórki [4,20]. Prawid³owy gen Bcl2 umiej-

scowiony jest na chromosomie 18q21, jednak w wyniku

translokacji zostaje przeniesiony, co prowadzi do zwiêk-

szonej ekspresji i nadprodukcji jego bia³kowego produk-

tu. Bia³ko Bcl2 o masie 26 kD, zbudowane jest z 239

aminokwasów [43]. Jest ono zakotwiczone w b³onach

mitochondrium, j¹dra i siateczki œródplazmatycznej.

W warunkach prawid³owych bia³ko to wystêpuje m.in.

w niezró¿nicowanych tkankach zarodkowych na okre-

œlonych etapach rozwoju i w komórkach stref proliferu-

jacych (np. komórki macierzyste uk³adu krwiotwórcze-

go, warstwy podstawnej naskórka, przewody wyprowa-

dzaj¹ce gruczo³ów wydzielania wewnêtrznego, komórki

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: