Miedzybloniak_badImmunohist_roznicowanie.pdf

PRACA ORYGINALNA

Ewa Szczepulska-Wójcik 1 , Renata Langfort 1 , Kazimierz Roszkowski-Śliż 2

Zakład Patomorfologii Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie

P.o. kierownika: dr n. med. R. Langfort

III Klinika Chorób Płuc Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie

Kierownik: prof. dr hab. med. K. Roszkowski-Śliż

Ocena przydatności reakcji immunohistochemicznych

w różnicowaniu międzybłoniaka złośliwego opłucnej

z rakami niedrobnokomórkowymi naciekającymi opłucną

i odczynowym rozrostem międzybłonka

A comparative evaluation of immunohistochemical markers for the differential

diagnosis between malignant mesothelioma, non-small cell carcinoma involving

the pleura, and benign reactive mesothelial cell proliferation

Abstract

Introduction: Histopathological diagnosis of malignant mesothelioma (MM) and differentiating it from tumors infiltrating the

pleura is very difficult. Distinguishing benign reactive mesothelial cell proliferation from MM also presents problems.

The objective of this study was to evaluate the significance of selected immunohistochemical stains in differentiating MM

from non-small cell lung cancers infiltrating the pleura and from benign reactive mesothelial cell proliferation.

Material and methods: The material encompassed 86 cases of MM, 54 cases of NSCLC infiltrating the pleura, and 43 cases

of benign reactive mesothelial cell proliferation. The MM cases were reclassified according to the WHO criteria (2004):

epithelioid, 61 cases (71%), including well-differentiated papillomatous, 3 cases; sarcomatous, 6 cases (6.8%); fibrous,

4 cases (4.7%); biphasic, 15 cases (17.5%).

A panel of immunohistochemical stains was used in this study. It included broad-spectrum antibodies to cytokeratins

(CKAE1/AE3, CKMNF116), vimentin, epithelial membrane antigen (EMA), mesothelial cells (HBME1, CK5/6, calretinin),

adenocarcinoma cells (BerEp4, B72.3, CEA, TTF1), antibodies enabling the assessment of proliferation (Mib1) and cell-cycle

regulating proteins (p53).

Results: Coexpression of cytokeratins and vimentin was found in 63.9% of MM cases and cell-membrane reactions with

EMA were seen in 58.9%. Positive staining for HBME1, CK5/6, calretinin, BerEp4, B72.3, CEA and p53 was obtained in

76.7%, 51.2%, 66.7%, 1.2%, 6.2%, 1.2% and 51% of the cases, respectively. None of the MM cases stained for TTF1. MM by

WHO subgroups: Coexpression of cytokeratins and vimentin occurred in 55.7% cases of epithelioid MM, 93.3% of biphasic

MM, 66.6% of sarcomatous MM, and in 100% of fibrous MM cases. Positive staining for HBME1, CK5/6, and calretinin was

seen only in the epithelioid and mixed subtypes of MM; the respective percentages of positive reactions were: HBME1,

90.2% and 73.3%; CK5/6 58.2% and 53.3%; calretinin, 72% and 75%. Non-small cell lung cancers infiltrating the pleura:

Coexpression of cytokeratin and vimentin was found in 17.6% of the cases, positive staining of membranes for EMA, in 13%

cases. Positive staining for HBME1 was observed in 22.6% of the cases, for CK5/6, in 9.3%, for calretinin, in 2%, for BerEp4, in

72.2%, for B72.3, in 64.1%, for CEA, in 58.5%, and for TTF1, in 43.8%. Benign reactive mesothelial cell proliferation: Protein p53

was present in 9.3% of cases, whereas no positive staining for EMA was found. Differentiation of MM from non-small cell

carcinomas: Among the antibodies used in the study, anti-HBME1 had the highest sensitivity (76.7%) but lowest specificity

(77.4%). Staining for calretinin showed high specificity (99.8%), as did CEA and TTF1 (98.8% and 100%), with moderate

sensitivity (66.7%, 58.5% and 43.8%, respectively). BerEp4 showed the highest sensitivity (72.2%) and specificity (98.8%).

Adres do korespondencji: Ewa Szczepulska-Wójcik, Zakład Patomorfologii Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc, ul. Płocka 26, 01–138 Warszawa,

tel.: (022) 431 22 57; faks: (022) 431 24 27, e-mail: e.szczepulska@igichp.edu.pl

Praca wpłynęła do Redakcji: 6.12.2006 r.

ISSN 0867–7077

www.pneumonologia.viamedica.pl

Adres do korespondencji:

Pneumonologia i Alergologia Polska 2007, tom 75, nr 1, strony 57–69

Conclusion: In diagnosing mesothelioma it is necessary to use a panel of immunohistochemical stains, which should

contain antibodies to markers for adenocarcinoma and mesothelioma. Due to the high costs of such a study, a two-stage

method is advantageous. The best combination of sensitivity and specificity was found for BerEp4, CEA, and TTF1 and for

calretinin and HBME1. In the diagnosis of spindle-cell pleural tumors and the fibrous form of MM and benign reactive mesothe-

lial cell proliferation , markers of mesothelial cells are noncontributory. Immunohistochemical staining fails to identify a reactive

process, but a diffuse, positive stain for EMA and the presence of protein p53 support the diagnosis of MM.

Key words: malignant mesothelioma, pleura, non-small cell carcinoma, mesothelial proliferation, immunohistochemical stains

Pneumonol. Alergol. Pol. 2007; 75: 57–69

Streszczenie

Wstęp: Rozpoznanie histopatologiczne międzybłoniaka złośliwego (MM), różnicowanie z nowotworami naciekającymi

opłucną nastręcza duże trudności. Również odróżnienie rozrostu odczynowego mezotelium od MM nie jest łatwe. Celem

pracy była ocena przydatności wybranych przeciwciał immunohistochemicznych w różnicowaniu MM z rakami niedrobnoko-

mórkowymi naciekającymi opłucną i rozrostem odczynowym międzybłonka.

Materiał i metody: Materiał obejmował 86 przypadków międzybłoniaka złośliwego opłucnej (MM), 54 przypadki raków

niedrobnokomórkowych naciekających opłucną oraz grupę rozrostów odczynowych międzybłonka (43 przypadki). Przypadki

MM reklasyfikowano według klasyfikacji WHO z 2004 roku: nabłonkowatokomórkowy — 61 przypadków (71%), w tym

brodawkowaty dobrze zróżnicowany — 3 przypadki, mięsakowy — 6 przypadków (6,8%), włóknisty — 4 przypadki (4,7%),

mieszany — 15 przypadków (17,5%).

W badaniach wykorzystano panel przeciwciał immunohistochemicznych obejmujący cytokeratyny o szerokim spektrum

(CKAE1/AE3, CKMNF116), wimentynę, antygen błonowo-nabłonkowy (EMA), przeciwko komórkom międzybłonka (HBME1,

CK 5/6, kalretynina), przeciwko komórkom raka gruczołowego (BerEp4, B72.3, CEA, TTF1), przeciwciała pozwalające na

ocenę proliferacji (MIB1) oraz białko regulujące cykl komórkowy (p53).

Wyniki: MM — koekspresję cytokeratyny i wimentyny uzyskano w 63,9% przypadków, reakcję błonową z przeciwciałem

EMA obserwowano w 58,9% przypadków. Dodatnie reakcje z przeciwciałami HBME1, CK5/6, kalretyniną, BerEp4, T73.2,

CEA i p53 uzyskano odpowiednio w 76,7%, 51,2%, 66,7%, 1,2%, 6,2%, 1,2% i 51% przypadków. Reakcje z przeciwciałem

TTF1 we wszystkich przypadkach MM były ujemne. MM według podtypów WHO — koekspresja cytokeratyny i wimentyny

występowała w 55,7% MM nabłonkowatokomórkowego, 93,3% MM mieszanego, w 66% MM mięsakowego oraz w 100%

typu włóknistego MM. Dodatnie reakcje z przeciwciałami HBME1, CK5/6, kalretyniną uzyskano tylko w postaciach nabłonko-

watokomórkowej i mieszanej MM; dla obu tych typów odpowiednio: HBME1 — 90,2% i 73,3%, CK5/6 — 58,2% i 53,3%,

kalretynina — 72% i 75%. Raki niedrobnokomórkowe naciekające opłucną — koekspresja cytokeratyny i wimentyny występo-

wała w 17,6% przypadków, reakcja błonowa z przeciwciałem EMA — w 13% przypadków. Dodatnie reakcje obserwowano dla

przeciwciała HBME1 w 22,6% przypadków, CK5/6 w 9,3% przypadków, kalretyniny w 2% przypadków, BerEp4 w 72,2%

przypadków, B73.2 w 64,1% przypadków, CEA w 58,5% przypadków i TTF1 w 43,8% przypadków. Odczynowy rozrost

międzybłonka — obecność białka p53 występowała w 9,3% przypadków, zaś reakcja błonowa z przeciwciałem EMA była

negatywna w 100%. Różnicowanie między MM a rakami niedrobnokomórkowymi — spośród przedstawionych przeciwciał

największą czułość (76,7%) wykazało HBME1, przy jednocześnie najniższej swoistości (77,4%). Wysoką swoistość wykazy-

wała kalretynina (99,8%) oraz CEA i TTF1 (98,8% i 100%), przy średniej czułości (odpowiednio 66,7%, 58,5% i 43,8%).

Najwyższą czułością (72,2%) i swoistością (98,8%) charakteryzowało się BerEp4.

Wnioski: W rozpoznawaniu międzybłoniaka konieczne jest stosowanie panelu przeciwciał immunohistochemicznych, który

powinien zawierać markery raka gruczołowego i międzybłonka. Ze względu na duże koszty takiego badania, korzystne jest

wykonywanie badań w dwóch turach. Najkorzystniejszą kombinację czułości i swoistości wykazują BerEp4, CEA i TTF1 oraz

kalretynina i HBME1. W rozpoznawaniu nowotworów wrzecionowatokomórkowych opłucnej oraz postaci włóknistej MM

i odczynowego włóknienia opłucnej ( pleuritis fibrosa ) nie mają zastosowania markery komórek międzybłonka. Barwienia

immunohistochemiczne nie pozwalają na jednoznaczne rozpoznanie procesu odczynowego, jednak w przypadku uzyskania

rozlanej, dodatniej reakcji błonowej z przeciwciałem EMA i wykazaniu obecności białka p53 przemawiają za rozpoznaniem MM.

Słowa kluczowe: międzybłoniak złośliwy, opłucna, rak niedrobnokomórkowy, rozrost międzybłonka, barwienia

immunohistochemiczne

Pneumonol. Alergol. Pol. 2007; 75: 57–69

Wstęp

W ostatnich latach częstość jego występowa-

nia wyraźnie wzrasta. Najprawdopodobniej wiąże

się to z wieloletnim stosowaniem w przemyśle

azbestu, uznanego za najistotniejszy czynnik pa-

togenetyczny w rozwoju choroby.

Międzybłoniak złośliwy jest nowotworem

o złym rokowaniu [2, 3]. Większość pacjentów umie-

ra w pierwszym roku od rozpoznania choroby.

Międzybłoniak złośliwy (MM, mesothelioma

malignum ) jest rzadkim nowotworem wywodzą-

cym się z komórek wyściółki opłucnej, osierdzia

i otrzewnej. Najczęściej rozwija się w opłucnej i sta-

nowi 1–3% wszystkich złośliwych guzów o tej lo-

kalizacji [1, 2].

www.pneumonologia.viamedica.pl

Ewa Szczepulska-Wójcik i wsp., Międzybłoniak złośliwy opłucnej

Średnie przeżycie wynosi 6–18 miesięcy, chociaż

zdarzają się również przypadki długoletnich przeżyć

[1, 4]. Istotne znaczenie ma wykluczenie innych no-

wotworów zajmujących opłucną, charakteryzujących

się lepszym rokowaniem, a przede wszystkim dają-

cych większe i skuteczniejsze możliwości leczenia.

Rozpoznanie MM wymaga diagnostyki histo-

patologicznej, często bardzo trudnej, co wynika

z różnorodności obrazów morfologicznych MM, któ-

re mogą przypominać inne procesy nowotworowe

i nienowotworowe opłucnej. Z kolei wtórne zajęcie

opłucnej przez raki pierwotne płuca i przerzutowe

może imitować MM. Również odróżnienie odczy-

nowego rozrostu mezotelium od nowotworowego

nie zawsze jest łatwe. W związku z tym, mimo usta-

lenia ścisłych kryteriów morfologicznych rozpozna-

wania MM, zwykle niezbędne jest wykonanie bar-

wień immunohistochemicznych pobranych wycin-

ków, najlepiej drogą wideotorakoskopii. Pozwalają

one na ustalenie właściwego rozpoznania w 70–90%

przypadków. Natomiast badania cytologiczne pły-

nu z jamy opłucnowej i wycinków z biopsji igłowej

opłucnej nie zawsze umożliwiają ostateczną diagno-

zę, ze względu na ograniczone możliwości wyko-

nania pełnej diagnostyki immunohistochemicznej.

Celem pracy była ocena przydatności reakcji

immunohistochemicznych w różnicowaniu MM

z rakami naciekającymi opłucną oraz MM z rozro-

stem odczynowym międzybłonka na podstawie

wybranych przeciwciał monoklonalnych.

Grupę 43 przypadków odczynowego rozrostu

międzybłonka stanowiło 15 kobiet i 28 mężczyzn.

Wycinki do badania mikroskopowego pobierano

z powodu utrzymującego się płynu w opłucnej

(5 przyp.), odmy (25 przyp.), rozedmy (3 przyp.),

nowotworu płuca (7 przyp.), z innych powodów

(3 przyp.).

Przypadki MM reklasyfikowano według kla-

syfikacji WHO z 2004 roku:

— nabłonkowatokomórkowy — 61 przypadków

(71%), w tym brodawkowaty dobrze zróżnico-

wany — 3 przypadki;

— mięsakowy — 6 przypadków (6,8%);

— włóknisty — 4 przypadki (4,7%);

— mieszany — 15 przypadków (17,5%).

Metody

W zbadanych przypadkach MM i raków na-

ciekających opłucną zastosowano panel przeciw-

ciał immunohistochemicznych obejmujący trzy

grupy przeciwciał:

— przeciwko filamentom pośrednim (cytokeratyna

o szerokim spektrum: CKAE1/AE3, CKMNF116,

wimentyna) oraz przeciwko antygenom błony

komórkowej komórek nabłonkowych (EMA);

— przeciwko komórkom międzybłonka (HBME1,

CK5/6, kalretynina) — markery dodatnie w MM;

— przeciwko komórkom raka gruczołowego (Ber-

Ep4, B72.3, CEA, TTF1) — markery ujemne

w MM;

— przeciwciała pozwalające na ocenę białek re-

gulujących cykl komórkowy (p53).

Materiał

Materiał obejmował 86 przypadków między-

błoniaka złośliwego opłucnej (MM) rozpoznanych

w latach 1991–2003 w Zakładzie Patomorfologii

Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc, 54 przypadki

raków niedrobnokomórkowych naciekających

opłucną oraz 43 przypadki rozrostów odczyno-

wych międzybłonka.

Grupę 86 przypadków MM stanowiły 32 kobie-

ty i 54 mężczyzn. Mediana wieku dla całej grupy

wynosiła 56 lat, dla kobiet — 52 lata, dla mężczyzn

— 57 lat. Materiał do badania pochodził

z biopsji opłucnej, torakoskopii, torakotomii, w trak-

cie których pobierano wycinki (19 przyp.), dekor-

tykacji (51 przyp.) lub pneumonektomii (15 przyp.).

Wśród 54 przypadków raków niedrobnoko-

mórkowych naciekających opłucną było 17 kobiet

i 37 mężczyzn. Mediana wieku całej grupy wyno-

siła 64 lata, kobiet — 66 lat, natomiast mężczyzn

— 57 lat. W badanej grupie 41 guzów stanowił rak

gruczołowy płuca, 11 przypadków — rak niedrob-

nokomórkowy bez oceny podtypu, 2 przypadki —

przerzuty raka spoza płuca.

Reakcje immunohistochemiczne

Do badania immunohistochemicznego wybie-

rano bloczek parafinowy zawierający dostateczną

ilość reprezentatywnego materiału: bez zmian

martwiczych, w postaciach mieszanych MM za-

wierający różne utkania.

Reakcje immunohistochemiczne z wszystkimi

przeciwciałami wykonywano ściśle według zaleceń

producenta. Stosowane rozcieńczenia i metodę

odsłaniana antygenów dla poszczególnych przeciw-

ciał przedstawiono w tabeli 1. Kontrolę dodatnią

dla przeciwciał: cytokeratyn o szerokim spektrum,

wimentyny, EMA, TTF1, HBME1, kalretyniny

i CK5/6 stanowiły występujące w preparatach pra-

widłowe tkanki (komórki międzybłonka, utkanie

gruczołowe płuca, podścielisko łącznotkankowe).

Kontrolę dodatnią dla przeciwciał BerEp4, B72.3,

CEA stanowiły wycinki zawierające utkanie raka

gruczołowego oraz dla białka p53 — nisko zróż-

nicowane postacie MM. Kontrolę negatywną dla

wszystkich przeciwciał stanowiły skrawki bar-

www.pneumonologia.viamedica.pl

Pneumonologia i Alergologia Polska 2007, tom 75, nr 1, strony 57–69

Tabela 1. Warunki reakcji immunohistochemicznych w odniesieniu do zastosowanych przeciwciał

Table 1. Details of immunohistochemical reactions according to different antibodies

Przeciwciała

Producent

Typ przeciwciała

Odsłanianie antygenów

Rozcieńczenie

Antibodies

Producer

Type of antibody

Antigen retrieval

Dilution

Cytokeratyna AE1/AE3

Koktail dwóch monoklonalnych

Kuchenka mikrofalowa

przeciwciał AE1 i AE3

Cytokeratin AE1/AE3

DAKO

Coctail of two monoclonal

antibodies AE1 and AE3

Microwave

1:50

Cytokeratyna MNF116

Przeciwciało monoklonalne

Kuchenka mikrofalowa

Cytokeratin MNF116

DAKO

Monoclonal antibody

Microwave

1:100

Wimentyna

Przeciwciało monoklonalne

Kuchenka mikrofalowa

Vimentin

DAKO

Monoclonal antibody

Microwave

1:100

HBME-1

Przeciwciało monoklonalne

Nie wymaga

HBME-1

DAKO

Monoclonal antibody

Unnecessary

1:50

Cytokeratyna 5/6

Przeciwciało monoklonalne

Kuchenka mikrofalowa

Cytokeratin 5/6

DAKO

Monoclonal antibody

Microwave

1:50

Kalretynina

Przeciwciało monoklonalne

Kuchenka mikrofalowa

Calretinin

Novocastra

Monoclonal antibody

Microwave

1:100

Ber-EP4

Przeciwciało monoklonalne

Kuchenka mikrofalowa

Ber-EP4

DAKO

Monoclonal antibody

Microwave

1:50

B72.3

Przeciwciało monoklonalne

Nie wymaga

B72.3

Bio-Genex

Monoclonal antibody

Unnecessary

1:100

CEA (antygen rakowo-płodowy)

Przeciwciało monoklonalne

Kuchenka mikrofalowa

CEA (carcinoembryonic antigen)

DAKO

Monoclonal antibody

Microwave

1:30

TTF1

Przeciwciało monoklonalne

Kuchenka mikrofalowa

TTF1

DAKO

Monoclonal antibody

Microwave

1:200

EMA (antygen błonowy komórek

Przeciwciało monoklonalne

Kuchenka mikrofalowa

nabłonkowych)

EMA (epithelial membrane antigen)

DAKO

Monoclonal antibody

Microwave

1:50

Białko p53

Przeciwciało monoklonalne

Kuchenka mikrofalowa

p53 protein

Novocastra

Monoclonal antibody

Microwave

1:50

wione według tej samej metody z zastosowaniem

surowicy cielęcej zamiast właściwego przeciw-

ciała.

-Smirnowa (K-S) oraz Shapiro-Wilka (S-W), a tak-

że metod statystycznych, analizy dyskryminacyj-

nej oraz regresji logistycznej.

Czułość badanych markerów przedstawiono

jako prawdopodobieństwo dodatniej reakcji, jeże-

li guz należy do wybranej kategorii. Natomiast

swoistość oceniano jako prawdopodobieństwo

wyniku ujemnego, jeżeli guz nie należy do wybra-

nej kategorii.

Ocena reakcji immunohistochemicznych

Ekspresję antygenów oceniano w mikroskopie

świetlnym, uznając za dodatni wynik obecność

brązowego zabarwienia we właściwej dla danego

antygenu lokalizacji (reakcja błonowa, jądrowa lub

cytoplazmatyczna). Dla przeciwciał TTF1 i kalre-

tyniny za reakcję dodatnią uznawano tylko zabar-

wienie jądrowe, natomiast w przypadku HBME1

i BerEp4 — tylko odczyn błonowy.

W reakcji z przeciwciałem EMA oceniano spo-

sób zabarwienia komórki — cytoplazmatyczny (c)

lub błonowy (b).

Do analizy wyników użyto testów statystycz-

nych Pearsona c 2 (Pchi) i największego prawdopo-

dobieństwa chi-kwadrat (MLchi), Kołmogorowa-

Wyniki

Międzybłoniak złośliwy (MM) (ryc. 1)

Spośród 86 przebadanych MM ekspresję cy-

tokeratyny stwierdzono w 98% przypadków, wi-

mentyny w 69,8%, a koekspresję cytokeratyny

i wimentyny uzyskano w 63,9% przypadków, re-

akcję błonową z przeciwciałem EMA stwierdzo-

no zaś w 58,9% przypadków. Dodatnie reakcje

www.pneumonologia.viamedica.pl

Ewa Szczepulska-Wójcik i wsp., Międzybłoniak złośliwy opłucnej

Rycina 1. Wyniki reakcji immunohistochemicznych w grupach międzybłoniaków (MM) i raków niedrobnokomórkowych (CA) naciekających opłucną

Figure 1. Results of immunohistochemical staining in the groups of malignant mesothelioma and non-small cell carcinomas infiltrating the pleura

Rycina 2. Wyniki reakcji immunohistochemicznych w poszczególnych podgrupach międzybłoniaków

Figure 2. Immunohistochemical expression of markers by histological suptype of malignant mesothelioma

z przeciwciałami HBME1, CK5/6 i kalretyniną wy-

stąpiły odpowiednio w 76,7%, 51,2% i 66,7%

przypadków. Pozytywne wyniki z markerami raka

gruczołowego — BerEp4, B72.3 i CEA — uzyska-

no w 1,2%, 6,2% i 1,2% przypadków. Natomiast

z przeciwciałem TTF1 reakcje we wszystkich

przypadkach MM były ujemne. Obecność białka

p53 wykazano w 51% MM.

rami komórek mezotelialnych uzyskano w posta-

ciach nabłonkowatokomórkowej i mieszanej MM,

dla obu tych typów odpowiednio: HBME1

— 90,2% i 73,3%, CK5/6 — 58,2% i 53,3%, kalre-

tynina — 72% i 75%. Natomiast we wszystkich

przypadkach MM mięsakowego i włóknistego re-

akcje z przeciwciałami z grupy dodatnich w mię-

dzybłoniakach oraz grupy dodatnich w rakach gru-

czołowych wypadły ujemnie. Dla przeciwciał dodat-

nich w rakach gruczołowych uzyskano pozytywne

wyniki w pojedynczych przypadkach MM typu na-

błonkowatokomórkowego i mieszanego; po jednym

przypadku dodatniej reakcji z BerEp4 i B72.3 w MM

mieszanym oraz jeden przypadek dodatniego CEA

i 4 pozytywne reakcje z B72.3 w MM nabłonkowato-

komórkowym.

Międzybłoniak złośliwy — poszczególne

typy według WHO (ryc. 2)

Koekspresję cytokeratyny i wimentyny stwier-

dzono w 55,7% MM nabłonkowatokomórkowego,

93,3% MM mieszanego, w 2/3 przypadków MM

mięsakowego oraz we wszystkich przypadkach

MM typu włóknistego. Dodatnie reakcje z marke-

www.pneumonologia.viamedica.pl

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: