WYKŁAD 8.doc

WYKŁAD 8

Wypełnienie kolumny

- w wysokosprawnej chromatografii cieczowej kolumnowej – rozmiar ziaren 5-10μm

- cząsteczki mniejsze               od 3μm nie są stosowane, gdyż powodują zbyt duże opory fazy ruchomej.

Faza ruchoma

- rodzaj i ilość rozpuszczalników stanowiących eluenty w chromatografii cieczowej mają znacznie większy wpływ na proces chromatografowania niż gaz nośny w chromatografii gazowej.

- faza ruchoma w chromatografii cieczowej jest czynnikiem aktywnym – czasem niewielki dodatek drugiego rozpuszczalnika do eluentu wywiera duży wpływ na jakość rozdzielania składników mieszaniny

- przy wyborze fazy ruchomej należy uwzględnić rodzaj i skład rozdzielanej mieszaniny, rodzaj zastosowanego wypełnienia kolumny i rodzaj detektora.

Rozpuszczalniki stosowane jako fazy ruchome w HPLC powinny:

Należy umieć to na egzamin

- wykazywać odpowiednią zdolność rozpuszczania próbki

- umożliwiać detekcję próbki

- charakteryzować się wysokim stopniem czystości

- nie reagować chemicznie ani z fazą stacjonarną, ani z rozdzielaną próbką

- charakteryzować się trwałością w warunkach chromatografowania

Efektywność wymywania substancji z adsorbentu zależy od mocy elucyjnej rozpuszczalnika. Rozpuszczalniki sklasyfikowano wg wzrastającej mocy elucyjnej i powstały w ten sposób tzw. szeregi eluotropowe rozpuszczalników.

W przypadku polarnych faz stacjonarnych (np. żel krzemionkowy, tlenek glinu) rozpuszczalniki są ułożone wg rosnącej mocy elucyjnej następująco:

n-pentan, n-heksan, cykloheksan, tetrachlorek węgla, toluen, benzen, eter dietylowy, chloroform, dichlorometan, tetrahydrofuran, dichloroetan, aceton, octan etylu, acetonitryl, pirydyna, etanol, metanol, woda i kwas octowy.

Moc elucji przy chromatografowaniu na niepolarnej fazie stacjonarnej (np. węglowej) jest odwrotna i wzrost mocy elucji można obserwować               w szeregu:

woda, metanol, etanol, aceton, propanon, eter dietylowy, butanol, octan etylu, n-heksan, benzen.

Miarą mocy elucyjnej rozpuszczalników, czyli miarą ich zdolności wymywania substancji chromatografowanych z kolumny są indeksy polarności.

Chromatografia w normalnym układzie faz

Polarne fazy stacjonarne (np. żel krzemionkowy) i mniej polarne fazy ruchome (np. heksan, izooktan, chloroform, chlorek metylenu)

Chromatografia w odwróconym układzie faz

Faza stacjonarna słabo polarna lub niepolarna i bardziej polarna faza ruchoma (np. tetrahydrofuran, acetonitryl, metanol, woda)

Elucja izokratyczna

Skład mieszaniny jest jednakowy przez cały czas chromatografowania próbki (stała siła elucyjna)

Elucja gradientowa

W czasie rozdzielania składników jednej próbki skład eluentu zmienia się, a jego siła elucyjna się zwiększa, dlatego że po kolei wymywamy wszystkie składniki.

Zastosowanie

W przypadku chromatografowania w normalnym układzie faz mieszanin zawierających składniki znacznie różniące się polarnością.

W przypadku chromatografowania w odwróconym układzie faz mieszanin zawierających składniki o bardzo różnej rozpuszczalności w fazie ruchomej.

Dobór składu fazy ruchomej

Zasada ogólna:

1)     Analizę niepolarnych substancji (np. węglowodorów i ich pochodnych halogenowych lub związków tlenowych, zawierających duże rodniki węglowodorowe) które rozpuszczają się dobrze w hekasnie wykonuje się zwykle w odwróconym układzie faz. Stosuje się fazę ruchomą zawierającą 0-30% wody w metanolu lub acetonitrylu.

2)     Do bardzo słabo polarnych związków można stosować mieszaninę acetonitryl-chloroform lub acetonitryl-chlorek metylenu.

3)     Substancje o pośredniej polarności rozpuszczające się w estrach, alkoholu i chloroformie mogą oddziaływać z grupami aktywnymi żelu krzemionkowego i polarnymi grupami faz związanych z żelem krzemionkowym. Do ich analizy stosuje się mieszaniny zawierające 2-50% organicznego rozpuszczalnika polarnego w rozpuszczalniku niepolarnym – węglowodorze lub halogenowęglowodorze.

4)    

RACZEJ tego nie będzie na egzaminie.

5)     Wiele polarnych związków organicznych rozpuszcza się w wodzie i często rozdziela się je w odwróconym układzie faz. Faza ruchoma zawiera w tym przypadku 0-50% rozpuszczalnika organicznego (metanol, acetonitryl) w wodzie. Związki chromatografowane w takich warunkach opuszczają kolumnę w kolejności zminiejszającej się ich polarności.
Jeśli są to substancje jonowe to w celu poprawy efektywności chromatografowania do fazy ruchomej dodaje się sole, kwasy i roztwory buforowe.

6)     Związki jonowe chromatografuje się na wymieniaczach jonowych, stosując roztwory buforowe jako eluenty.

Eluenty izoeluotropowe – to mieszaniny rozpuszczalników mające różny skład, ale jednakową moc elucyjną. Mogą mieć różną selektywność, dzięki czemu bez zmiany retencji substancji chromatografowanych można lepiej rozdzielić składniki mieszaniny.

Do określenie przybliżonego składu eluentów izoeluotropowych służy nomogram.

Detektory:

W HPLC używane są przede wszystkim detektory spektrofotometryczne lub elektrochemiczne.

Ich zasada działania polega na rejestrowaniu różnicy określonej właściwości samego eluentu i roztworu substancji chromatografowanej w tym eluencie.

Najbardziej rozpowszechnionym detektorem w chromatografii cieczowej kolumnowej są detektory działające na zasadzie absorpcji światła nadfioletowego (UV) lub nadfioletowego i widzialnego (UV-Vis).

Najprostsze monochromatyczne detektory UV umożliwiają wykrywanie chromatografowanych substancji przy jednej długości fali – 254nm. Jest to długość fali światła pochłanianego przez większość substancji organicznych (65%), a jednocześnie łatwa do uzyskania technicznie za pomocą lampy rtęciowej.

Obecnie powszechnie stosowane są detektory spektrofotometryczne, w których możliwa jest płynna regulacja długości fali światła w całym zakresie nadfioletu i jego części widzialnej (190-600nm). Taki detektor po zatrzymaniu przepływu fazy ruchomej umożliwia rejestrację widma absorpcji substancji znajdującej się w detektorze i ustalenie długości fali, przy której występuje maksimum absorbancji, co pozwala na wykrycie substancji z maksymalną czułością.

Aby detektor UV dobrze działał użyty eluent nie powinien absorbować światła przy zastosowanej długości fali.

Detektor UV jest niewrażliwy na zmiany przepływu fazy ruchomej i na zmiany temperatury.

Zasada działania:

- światło lampy deuterowej jest skupione przez układ optyczny w komórce przepływowej, w której część światła jest absorbowana przez wykrywane substancje.

- następnie promień światła rozszczepiany na siatce dyfrakcyjnej pada na matrycę diodową (diody mogą rejestrować intensywność światła w zakresie 190-600nm w ciągu 10ms)

- każda fotodioda przeznaczona jest do pomiaru wąskiego spektrum światła. Jednoczesna rejestracja prądów z poszczególnych fotodiod umożliwia rejestrację całego widma absorpcji analizowanego związku chemicznego.

Detektor ten umożliwia stwierdzenie czy pik eluowany z kolumny, odpowiada jednej substancji czy może w jednym piku mieszczą się dwie substancje. Możliwe jest także wykonanie analizy ilościowej składników ukrytych w jednym piku.

Detektor fluorescencyjny

Istota detekcji fluorescencyjnej polega na pomiarze intensywności światło o określonej długości fali emitowanego przez wykrywany związek w wyniku jego wzbudzenia, które odbywa się światłem o większej energii niż światło emitowane.

Jest najbardziej specyficznym i selektywnym detektorem spośród wszystkich detektorów w chromatografii cieczowej.

Detekcja za pomocą detektora fluorescencyjnego jest najprostsza wówczas gdy wykrywany związek ma naturalną zdolność do fluorescencji. Jeśli nie to przeprowadza się związki niefluoryzujące we fluoryzujące. Wykonuje się to przed lub za kolumną dodając do analizowanej próbku lub do eluentu odzcynniki (np. chlorek densylu), które reagując ze związkami analizowanymi, tworzą ich fluoryzujące pochodne.

Stosując detektor fluorescencyjny należy pamiętać, że na uzyskane efekty detekcji wpływ ma rodzaj elementu.