ĆWICZENIE 5

Kataliza enzymatyczna - czynniki wpływające na aktywność enzymów

Wprowadzenie

Biochemiczne reakcje oksydoredukcyjne są podstawowymi procesami dostarczającymi energii niezbędnej dla przemian w organizmach żywych. Przyjmując za kryterium mechanizm działania, enzymy klasy oksydoreduktaz można ująć w cztery grupy:

1.      dehydrogenazy - katalizują odrywanie atomów wodoru i przenoszą je na inne enzymy czy też związki pośrednie, a nie mają zdolności przenoszenia, elektronów bezpośrednio na tlen;

2.      oksydazy - katalizują przenoszenie elektronów bezpośrednio na tlen. W pewnych przypadkach niektóre enzymy są zarówno oksydazami jak i dehydrogenazami tzn. odrywane od substratu elektrony przenoszą bezpośrednio na tlen bez udziału enzymów pośrednich;

3.      oksygenazy - katalizują wbudowywanie tlenu w cząsteczkę;

4.      hydroperoksydazy - obejmują dwie podgrupy enzymów: peroksydazy i katalazy. Obydwie podgrupy powodują rozkład nadtlenku wodoru. Peroksydaza rozkłada H2O2, a powstający tlen utlenia jakąś substancję, natomiast katalaza powoduje rozkład nadtlenku wodoru niezależnie od obecności akceptora tlenu.

1. Oksydazy

Enzymy te przenoszą wodór bezpośrednio na tlen atmosferyczny. Substratem są często mono- i polifenole. Spośród oksydaz duże znaczenie praktyczne ma oksydoreduktaza, zwana potocznie oksydazą fenolową. Enzym ten jest metaloproteidem zawierającym w swoim składzie miedź (ok. 0,2%), która przyjmuje elektrony od fenoli i przekazuje na tlen cząsteczkowy. Oksydaza fenolowa odgrywa dużą rolę w przemyśle spożywczym. Dzięki jej działaniu następuje ciemnienie przekroju rozciętego jabłka lub ziemniaka, efektem jej działania jest także kolor czarnej herbaty, chleba razowego.

Wykonanie doświadczenia

Przygotować wyciąg ziemniaczany przez umycie i obranie ziemniaka, utarcie na tarce i włożenie do woreczka płóciennego, a następnie, zanurzenie w zlewce z ok. 200 ml wody. Zawartość zlewki łagodnie mieszać. Uzyskuje się wodny ekstrakt enzymów i skrobi. Poczekać aż osad skrobi opadnie, ciecz nadosadową należy zdekantować i używać do doświadczeń.

Do 3 probówek wlać po 5 ml wyciągu ziemniaczanego. Do pierwszej dodać 10 kropli 1% roztworu fenolu, do drugiej 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny, do trzeciej 10 kropli 1 % roztworu pirogalolu. Zawartość probówek zamieszać i obserwować zmiany zabarwienia. Ponieważ reakcja przebiega dość wolno, w międzyczasie należy wykonać pozostałe doświadczenia

Wyniki doświadczeń

W określonych odstępach czasu notować nasilenie barwy w probówkach zawierających poszczególne fenole.

2. Katalaza

Katalaza jest nadzwyczaj szeroko rozpowszechnionym enzymem: występuje u zwierząt, roślin i wszystkich bakterii tlenowych. Katalizuje reakcję rozkładu nadtlenku wodoru do tlenu i wody według równania:

2 H2O2 → 2 H2O + O2

Katalaza jest metaloproteidem i w stanie krystalicznym zawiera 0,09% żelaza. Istnieje wiele inhibitorów katalazy. Sam nadtlenek wodoru w większych stężeniach powoduje dezaktywację enzymu. Hamująco działa również szereg substancji reagujących z żelazem trójwartościowym, koenzymu katalazy (cyjanki, siarczki, fluorki, hydroksyloamina).

Wykonanie doświadczenia

Przygotować dwie probówki z 5 ml wyciągu ziemniaczanego. Do pierwszej z nich dodać 1 ml 3% H2O2. Pod działaniem katalazy następuje obfite wydzielanie tlenu.

Drugą ogrzać do wrzenia w płomieniu palnika, po czym dodać 1 ml wody utlenionej. Zapisać w tabeli obserwacje.

Wyniki doświadczeń

3. Peroksydaza

Peroksydaza jest enzymem bardzo rozpowszechnionym w roślinach, występuje także u zwierząt i niektórych bakterii. Jej działanie podobnie jak katalazy związane jest z obecnością nadtlenku wodoru. Jednak nadtlenek wodoru nie jest rozkładany z wydzieleniem tlenu, ale wykorzystywany jest przez enzym w reakcjach utleniania wielu substratów - fenoli i amin aromatycznych.

Podobnie jak katalaza, koenzym peroksydazy zawiera żelazo. Jest mało wrażliwa na wysoką temperaturę i jeszcze w 100°C zachowuje częściowo swoją aktywność. Przebieg typowej reakcji katalizowanej przez peroksydazę przedstawia się następująco:

          peroksydaza

AH2 + H2O2  ——→ A + 2 H2O

Wykonanie doświadczenia

Do 3 probówek zawierających po 5 ml wyciągu ziemniaczanego wprowadzić do każdej probówki inną substancję po 10 kropli 1% roztworu fenolu, 1% roztworu pirokatechiny, 1% roztworu pirogalolu oraz do każdej probówki po 10 kropli 3% H2O2. Obserwować powstawanie barwy.

Do dwóch probówek odmierzyć po 5 ml wyciągu ziemniaczanego. Ogrzewać probówki w łaźni wodnej w temperaturze 70°C przez 10 min. Łaźnię wodną przygotować w sposób następujący: do zlewki nalać gorącej wody. Za pomocą termometru rtęciowego ustalić temperaturę wody nie wyższą niż 70°C, wstawić probówki z wyciągiem ziemniaczanym na 10 min. Po tym czasie do jednej dodać 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny, a do drugiej dodać 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny i 10 kropli 3% H2O2. Zanotować rezultaty eksperymentu.

Wyniki doświadczeń

Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej

Odczynniki:

0,1 mol/l bufor fosforanowy 7,0

1% roztwór skrobi

0,01% roztwór jodu w 0,02% KJ

0,9% NaCl

Wykonanie:

1.      Wykonanie roztworu amylazy ślinowej: 0,5 ml roztworu śliny rozcieńczyć w 100 ml 0,9% roztworu NaCl (dobrze wymieszać!)

2.      - Przygotować 4 probówki i oznaczyć je numerami od1-4. Do każdej z nich wprowadzić 2 ml buforu fosforanowego o pH 7,0 oraz 2 ml roztworu rozcieńczonej uprzednio amylazy ślinowej.

3.      - Zawartość probówki 1 zagotować nad palnikiem, a następnie wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 min., po czym ochłodzić.

4.      - Do każdej z czterech probówek dodać: 2 ml 1% roztworu skrobi oraz 2 krople 0,01% roztworu NaCl

5.      - Probówki nr 1 i 2 pozostawić w temperaturze pokojowej.

6.      - Probówkę nr 3 wstawić do zlewki z lodem

7.      - Probówkę nr 4 umieścić w łaźni wodnej o temp. 370C

8.      - po 10 min. Porównać zabarwienie w probówkach (skrobia nie rozłożona barwi się z jodem na kolor niebieski).

Wyniki doświadczeń