skrypt sadowka genet(1).doc

dr hab. Tadeusz Dobosz

PRAKTIKUM Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ

Materiały pomocnicze do zajęć z biologii molekularnej, diagnostyki molekularnej i medycyny molekularnej dla studentów Akademii Medycznej we Wrocławiu.

Wydanie internetowe.
Data ostatniej aktualizacji - 15 lutego 2005

Katedra Medycyny Sądowej Akademii Medycznej we Wrocławiu

Zakład Technik Molekularnych


Spis treści:

1.     Wykaz skrótów i objaśnienie terminów użytych w pracy

2.     Co zagraża pracownikowi laboratorium

3.     Materiał genetyczny człowieka

4.     Izolacja DNA i RNA

5.     Enzymy restrykcyjne

6.     Elektroforeza i detekcja DNA i RNA

7.     Blotting i hybrydyzacja

8.     Odwrotna transkrypcja

9.     Reakcja PCR

10. Sekwencjonowanie DNA

11. Zastosowanie biologii molekularnej w medycynie sądowej

12. Zastosowanie biologii molekularnej w seroantropologii

13. Zastosowanie biologii molekularnej w medycynie (terapia genetyczna)

14. Klonowanie DNA

15. Przewidywane kierunki rozwoju biologii molekularnej

1. Wykaz skrótów i objaśnienie terminów użytych w tekście.

A - adenina
Agaroza - polimer węglowodanowy, uzyskiwany z wodorostów, służy do łatwego

                (poprzez  rozgotowywanie) sporządzania żeli do elektroforezy
Autoklaw - ciśnieniowy sterylizator parowy
Blot - folia nylonowa, na którą przeniesiono analizowane fragmenty DNA
Blotting - przenoszenie fragmentów DNA z żelu na folię nylonową
C - cytozyna
cDNA - ang. Cloned Deoxyrybonucleic Acid - klonowany DNA, kwas

             deoksyrybonukleinowy, uzyskany z nici mRNA za pomocą techniki odwrotnej

             transkrypcji
Cis - po tej samej stronie (w odróżnieniu od trans - po drugiej stronie)
DNA - ang. Deoxyrybonucleic Acid - kwas deoksyrybonukleinowy
DTT - ang. Dithiotreitol - ditiotreitol, odczynnik redukujący mostki siarkowe w białkach
Dygestorium - wyciąg, szafka z wymuszoną wentylacją ("wciąga" szkodliwe opary)
Elektroforeza - metoda rozdziału naładowanych elektrycznie cząsteczek w polu

                        prądu elektrycznego stałego lub zmiennego (wprowadzona w 1937

                        roku przez Tiseliusa, nagroda Nobla w 1948 roku)
G - guanina

Genom - DNA zawarty w pojedynczym jądrze komórkowym zygoty

Glovesbox - komora do pracy z materiałem niebezpiecznym (z zamontowanymi na

                    stałe gumowymi rękawicami w przedniej szybie lub bocznych ściankach)
Helisa - struktura przestrzenna, złożona z dwu owiniętych wokół siebie łańcuchów
Kancerogen - substancja rakotwórcza
Kapilara - wypełniona rzadkim żelem cienka rurka szklana lub kwarcowa, ostatnio

                coraz częściej stosowana do elektroforezy produktów reakcji PCR lub

                reakcji sekwencjonowania DNA
Klenow'a fragment - polimeraza DNA strawiona tak dobraną proteazą, aby produkt

                                 trawienia zachował aktywność enzymatyczną
Laminar - komora, do której poprzez filtry jest nawiewane sterylne powietrze
MALDI - TOF - ang. Matrix Associated Laser Desorption Ionization - Time Of Flight –

                         technika analizy spektralnej, polegająca na odparowaniu laserem

                         próbki i pomiarze czasu, w którym sublimująca substancja dociera do

                         detektora
mg - miligram, 10-3 grama
Mg++ - jon magnezowy, aktywator polimeraz DNA, najczęściej dostarczany w postaci

           soli chlorkowej, rzadziej siarczanowej
Mitochondrium - "siłownia" komórki, oraganellum w którym zachodzą intensywne

                            procesy energetyczne, prowadzące do wytwarzania dużych ilości

                            ATP
Multi loci - próba (sonda) molekularna hybrydyzująca z wieloma fragmentami

                 restrykcyjnymi, dająca charakterystyczny wzór prążkowy, podobny do

                 kreskowego kodu towarowego
Mutagen - substancja powodująca mutacje (zmiany w DNA)
mpz - megapary zasad, odcinki DNA mierzone w jednostkach wyrażonych w

          milionach par
mRNA - ang. Messenger Rybonuleic Acid - informacyjny RNA, wzorzec do syntezy

              białek, kwas nukleinowy uzyskany z przepisania informacji z nici DNA na nić

              RNA, poddany enzymatycznej obróbce polegającej na wycięciu

              niepotrzebnych fragmentów (np. intronów)
N - którakolwiek z zasad (A, U, T, G, C)
ng - nanogram, 10-9 grama
Organellum - struktura komórkowa, odpowiedzialna za daną funkcję biologiczną (np.

                      mitochondria są głównym miejscem syntezy ATP w komórce)
Patogen - czynnik zakaźny
Palindrom - tekst, który można czytać jednakowo od początku i od końca (np. "kobyła

                    ma mały bok")
PCR - ang. Polymerase Chain Reaction - reakcja polimerazowa, namnażanie DNA in

           vitro, (metoda wprowadzona w 1986 roku przez Mullisa, nagroda Nobla w

          1993 roku)
pg - pikogram, 10-12 grama
plazmid - niewielki zamknięty (kolisty) łańcuch DNA w cytoplazmie bakterii,

                replikujący się samodzielnie, często determinuje odporność na antybiotyk
pmRNA - ang. Prematured Rybonuleic Acid - świeżo wytworzony RNA, jeszcze przed

                wycięciem niepotrzebnych fragmentów, potocznie także zwany "surowym

                transkryptem", w szeregu podręczników błędnie nazywany "mRNA"
Poli A - sekwencja kilkunastu adenin, charakterystyczna dla mRNA
Poli T - sekwencja komplementarna do poli A, wykorzystywana przy uzolacji mRNA
Prąd przemienny - prąd elektryczny, w którym biegunowość oscyluje (plus co chwila  

                              zamienia się miejscami z minusem)
Prąd stały - prąd elektryczny o stałej biegunowości (elektroda podłączona do

                   dodatniego źródła takiego prądu to anoda, do ujemnego to katoda)
Prąd zmienny - prąd elektryczny o stałej biegunowości, lecz o zmiennym (najczęściej

                         regularnie falującym) napięciu
Primer - odcinek DNA o długości na ogół od 15 do 30 pz, stosowany w reakcji PCR

              do "oflankowania" fragmentu DNA który ma być powielony w wyniku reakcji
Promotor - sekwencja DNA będąca sygnałem do rozpoczęcia syntezy pmRNA

pz - pary zasad, miara długości łańcucha DNA

Restryktaza - enzym restrykcyjny, bakteryjna nukleaza specyficznie rozcinająca

                      łańcuch DNA w ściśle określonym miejscu
RNA - ang. Ribonucleic Acid - kwas rybonukleinowy
RT-PCR - ang. Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction - reakcja

                 polimerazowa, namnażanie DNA in vitro przy użyciu jako wzorca nici nie

                 DNA, lecz RNA
Starter - patrz "primer"
T - tymina
Termocycler - amplifikator DNA, mechaniczne urządzenie będące w istocie

                       sterowaną mikroprocesorowo cieplarką, służące do namnażania in

                       vitro odcinka DNA o długości wyznaczonej przez primery

                       hybrydyzujące z obiema niciami DNA
Teratogen - substancja powodująca zaburzenia w rozwoju płodu
Transiluminator - stolik, emitujący poprzez filtr w blacie promieniowanie UV o

                            długości fali około 305 – 315 nm
Transkrypt - RNA zsyntetyzowane na macierzystej nici DNA
U - uracyl
UV - ang. Ultra Violet - promieniowanie nadfioletowe
V - wolt, jednostka napięcia prądu elektrycznego
v - łac. versus - oznacza "lub" względnie "albo"
wektor - przenośnik, "koń trojański", środek za pomocą którego dokonujemy

             transfekcji (przenosimy do jądra komórki obce jej DNA (np. plazmid z

             wklonowanym genem)
g - mikrogram, 10-6 grama
- znak oznaczający miejsce, w którym łańcuch DNA jest rozcinany przez restryktazę
- znak oznaczający kierunek działania enzymu
* - znak używany na oznaczenie allelu (np. CYP2D6*3 oznacza trzeci allel w układzie

     grupowym cytochromu)
   

2. Co zagraża pracownikowi laboratorium

Zagrożenia czyhające na biologa molekularnego można podzielić na zakaźne, chemiczne i fizyczne. Zostaną one kolejno omówione.

Zagrożenia zakaźne.
Związane są z zakaźnością badanego materiału biologicznego. Podczas pracy należy "na wszelki wypadek" traktować każdy dostarczony materiał biologiczny jako potencjalnie zakaźny, potencjalnie bardzo groźnym błędem jest dzielenie materiału a priori na "bezpieczny" i "niebezpieczny". Materiał genetyczny obecny w próbce biologicznej zwykle nie jest niszczony w wysokiej temperaturze, a więc próbki które zawierają mało białka teoretycznie można przed badaniem autoklawować, co w praktyce wydatnie zmniejsza niebezpieczeństwo zakażenia. Jeżeli takie postępowanie jest niemożliwe, bo próbka ulega koagulacji cieplnej, wówczas opakowanie należy przenieść pod włączone dygestorium, założyć rękawiczki i gogle i bardzo ostrożnie otworzyć (uwaga - czasami zawartość fiolki bywa pod ciśnieniem i potrafi "trysnąć"!). Pobrać część odpowiednią do badań, resztę zamknąć w zgrzanym foliowym worku i zamrozić do ewentualnej powtórki /po zakończonym badaniu spalić, lub po otwarciu worka i fiolki wrzucić do wiadra z rozcieńczonym podchlorynem sodu albo, w przypadku materiału w najwyższym stopniu zakaźnego - zasypać wapnem chlorowanym/. Przed izolacją kwasów nukleinowych z próbki skrzepłej krwi lub fragmentu tkanki często należy ją rozdrobnić, dobrze jest robić to za pomocą narzędzi jednorazowego użytku. Podczas izolacji materiału genetycznego klasyczną metodą (z użyciem m.in. fenolu i etanolu) zakaźność materiału znika i praca z wyizolowanym materiałem genetycznym bakterii i wirusów jest już całkowicie bezpieczna.

Zagrożenia chemiczne.
Najpoważniejszym zagrożeniem jest praca z odczynnikami do wybarwiania kwasów nukleinowych (np. z bromkiem etydyny - ethidium bromide). Praktycznie każda substancja wiążąca się z DNA ma działanie muta- lub kancerogenne. Nie należy dopuszczać do kontaktu tych substancji ze skórą ani wdychać pyłu lub oparów. Problemem ekologicznym jest pozbycie się resztek takiej substancji. W przypadku bromku etydyny sposób powszechny na świecie (kolumny jonowymienne) w Polsce jest bezużyteczny, ponieważ, jak dotąd, nie ma służb utylizujących wypełnione kolumny. Pozostaje sposób prymitywny i mniej skuteczny, polegający na dodawaniu łyżeczki nadmanganianu potasu na każdy litr roztworu bromku etydyny i po kilku godzinach wlewaniu niewielkiej ilości stężonego kwasu solnego - w takim środowisku zdecydowana większość mutagennej substancji ulega rozpadowi i można stosunkowo mało szkodząc środowisku po całonocnej inkubacji spuścić ciecz do kanalizacji.
Inna niebezpieczna mieszanina, odczynnik fenolowy, jest żrąca, silnie korodująca, mutagenna i trująca, a czysty gorący fenol używany do jej wytworzenia dodatkowo jest łatwopalny. Podczas sporządzania odczynnika fenolowego i późniejszej z nim pracy należy zachować najwyższą ostrożność. Chloroform, używany komplementarnie z fenolem ma działanie karcynogenne.
Sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS, sodium dodecyl sulphate) jest bardzo silnym detergentem w dużym stężeniu rozpuszczającym błony komórkowe, zwłaszcza "cienkościennych" komórek nabłonka układu oddechowego. Dodatkowo jest to substancja bardzo lekka, pylista i elektryzująca się (łatwo "odskakuje" od łopatki podczas nabierania). Unikać wdychania pyłu! W czasie ważenia należy zakładać maseczkę!
Obecnie odczynniki chemiczne, zwłaszcza sprowadzane z zagranicy, są dobrze opisane. Czytajmy ulotki dołączone do odczynników, studiujmy napisy na opakowaniach, nauczmy się międzynarodowych znaków ostrzegawczych (patrz ryc. 1.)

Zagrożenia fizyczne.
Najpoważniejsze do niedawna zagrożenie fizyczne w pracowni biologii molekularnej, czyli promieniowanie jonizujące izotopów radioaktywnych obecnie w praktyce prawie przestało istnieć. Nie ma już konieczności stosowania izotopów, znakowania radioaktywne prawie całkowicie zostały wyparte przez nie radioaktywne (biotyną, antygenem lub enzymem). Izotopy są (i pewnie jeszcze długo będą) stosowane w "starych" laboratoriach, w których po latach owocnej pracy ciężko zarzucić rutynową, sprawdzoną technologię i przestawić się na nową, nie radioaktywną. Należy to uszanować, ale nowo tworzone pracownie powinny unikać stosowania izotopów od początku swojej działalności. Szczególnie niebezpieczny jest radioaktywny fosfor, paradoksalnie dlatego, że "krótko żyje". Zwykle w pracowni mamy naskładane całe sterty blotów, a gdy przyjdzie wreszcie wytęskniona dostawa izotopu to pracujemy cały dzień i jeszcze długo w nocy, a o drugiej nad ranem jakże łatwo o nieostrożność, nieuwagę i wypadek.
Niedocenianym zagrożeniem jest promieniowanie ultrafioletowe, którego źródła w pracowni to lampy sterylizujące podsufitowe i w laminarach oraz transiluminatory. Należy chronić całą twarz przesłoną (a już koniecznie co najmniej oczy specjalnymi okularami), zakładać rękawiczki. Wietrzyć pracownię z nadmiaru tworzącego się pod wpływem UV ozonu! Rozpada się on na tlen cząsteczkowy i osławiony wolny rodnik tlenowy (anionorodnik ponadtlenkowy).
Pracownia biologii molekularnej to nieprzeliczone mrowie aparatów podłączonych do sieci elektrycznej, co zwiększa możliwość porażenia prądem. Zastosowanie nowoczesnych anty porażeniowych instalacji elektrycznych (z wyłącznikami różnicowo-prądowymi) jest wskazane, ale nie zawsze zdaje egzamin ponieważ taki zabezpieczenia są bardzo czułe i bywa, że działają bez potrzeby, a spowodowane odłączeniami prądu awarie są niezmiernie przykre w skutkach, a bywa, że i niesłychanie kosztowne. Absolutne minimum bezpieczeństwa to wszystkie gniazdka elektryczne w pracowni ze sprawnym zerowaniem (są to gniazdka z wystającymi metalowymi "kołkami").

Środki ochrony.
Fartuch laboratoryjny to nie fason ani moda. To nasza najważniejsza obrona przed zabrudzeniem odzieży chemikaliami i patogenami. Mniej twarzowe, ale skuteczniejsze są fartuchy wiązane z tyłu. W czasie przebywania w laboratorium ręce płuczemy dosłownie co chwila, ale mydła używamy tylko przed posiłkiem i przed wyjściem z pracy. Jeżeli ktoś "nie może" myć rąk samą wodą, to niech używa kremu natłuszczającego, bo odtłuszczona ludzka skóra to istne sito... Pracujemy w rękawiczkach, to chroni nas przed badanym materiałem i ... badany materiał (zwłaszcza RNA) przed nami. Wyciąg (dygestorium) jest po to, aby chronić pracownika przed robotą (próbkami). Komora z laminarnym przepływem powietrza jest po to, aby chronić robotę (tzn. próbki, zwłaszcza podczas nastawiania testu PCR) przed pracownikiem (zanieczyszczenie). Komora sterylna (glovesbox) służy do bezpiecznej pracy z wyjątkowo niebezpiecznym materiałem, chroni więc skutecznie "obie strony".

REPETYTORIUM
Jeżeli potrafisz odpowiedzieć na zadane pytania, opanowałeś materiał z powyższego wykładu. Jeżeli masz wątpliwości, zgłoś się do wykładowcy na konsultację.
1. Wszystko, co biologiczne, i tak wcześniej lub później zgnije, a na śmietniku leżą i w kanalizacji pływają wszelkie możliwe odpadki. Czy w związku z tym resztki przebadanych próbek śmiało możemy wyrzucić na śmietnik lub wylać do kanalizacji?
2. Wirus, biologicznie rzecz biorąc, to, z niewielką przesadą, prawie czysty materiał genetyczny. Czy to znaczy, ze wyizolowany wirusowy DNA lub RNA też jest zakaźny?
3. Bromek etydyny jest szkodliwy. Ale są znane także inne, nowocześniejsze i znacznie czulsze barwniki do kwasów nukleinowych. Czy one też są szkodliwe?
4. SDS w substancji to okropne paskudztwo. A w roztworze, kilku- lub kilkunastoprocentowy?
5. Czy "ciernista koniczynka" to znak ostrzegający przed radioaktywnością?
6. Nowe technologie znakowania prób /sond/ molekularnych są może i dobre, ale jeszcze długo nie zastąpią izotopów fosforu i siarki, bo radioaktywne znakowania są tańsze i czulsze, nieprawdaż?
7. Ozon to zdrowy, orzeźwiający gaz który na wakacjach czujemy w powietrzu po burzy. Jest więc oczywistością, że dobrze działa na nasze zdrowie także wtedy, gdy codziennie wdychamy go w naszym laboratorium, prawda?
8. Prawdziwa higiena jest wtedy, gdy nie żałujemy mydła, czy z tego wynika, że mycie rąk samą wodą nie ma żadnego sensu?
9. Do czego w pracowni biologii molekularnej służą dygestorium, laminar i glovesbox?
   

3. Materiał genetyczny człowieka.

W chwili pisania tych słów zastosowanie diagnostyczne w medycynie człowieka znalazły dwa rodzaje DNA, pochodzący z jądra komórkowego (zwany także DNA genomowym) oraz pochodzący z mitochondriów.  W tym miejscu należy się lingwistyczna dygresja: DNA to kwas, czyli rodzaj męski. Studenci jednak często mówią o nim w rodzaju nijakim, „to DNA”. Jest to błąd gramatyczny, ale mnie on się podoba. W końcu DNA jest bezpłciowy (bezpłciowe!) i dobrze służy obu płciom, a więc ta  gramatycznie błędna forma jest za to bardzo politycznie poprawna.
Ludzki genomowy DNA w pojedynczym jądrze komórkowym ma łączną długość około 3 miliardów nukleotydów i waży około 7 pg. Wypreparowany z jednej gamety utworzyłby helisę o całkowitej długości około 1 metra (a po jej rozwinięciu i naciągnięciu nitek do granic fizycznej wytrzymałości około półtora metra). Około 95% tego DNA nie pełni żadnej znanej nam funkcji, istnieją hipotezy że jest to regulator aktywności genów, "wypełniacz" chromosomów, pamiątka po prastarych przemianach ewolucyjnych a nawet... plan ewolucyjnych zmian które dopiero zajdą w przyszłości. Kodująca część genomu człowieka ma więc długość zaledwie około 150 mpz i zawiera ponad 30.000 genów. Ludzki DNA podzielony jest na 46 "kawałków", każdy odcinek tworzy jeden chromosom, największy z nich (nr 1) jest około sześć razy większy od każdego z najkrótszych (21, 22 i Y).
W porównaniu z DNA genomowym, DNA mitochondrialne na pierwszy rzut oka wygląda bardzo niepozornie, ponieważ obejmuje tylko około 16.000 pz. Jeżeli jednak uwzględnimy, że w komórce jest tylko jedno jądro ze 150 milionami kodujących zasad, natomiast kilkaset, a nawet więcej, mitochondriów, to niespodziewanie okaże się, że k...