FUNKCJA BIAŁEK
§ Z funkcjonowaniem białek związane jest odwracalne wiązanie innych cząsteczek – ligandów. Ligandem może być każdego typu związek chemiczny, nie wykluczając innego białka
§ Istotną cechą oddziaływania białko-ligand jest jego przejściowość. Umożliwia to organizmowi szybką odpowiedź na zmieniające się warunki otoczenia
§ Oddziaływanie białko – ligand jest bardzo specyficzne. Ligand wiąże się ze ściśle określonym miejscem wiążącym, które jest komplementarne do liganda pod względem rozmiaru, kształtu, ładunku, hydrofobowości czy hydrofilności
§ Cząsteczka białka może mieć kilka miejsc wiążących dla różnych ligandów
§ Wiązanie liganda z białkiem często prowadzi do zmian konformacyjnych, od bardzo subtelnych (drgania cząstecz-kowe, niewielkie przemieszczenia amino-kwasów) do bardzo głębokich (przesunię-cie się wobec siebie całych segmentów struktury, nieraz o kilkanaście do kilkudziesięciu nanometrów)
§ Wstępne związanie ligandu może powodować zmiany strukturalne prowa-dzące do ściślejszego wiązania. Tego typu adaptacja nosi nazwę indukowa-nego dopasowania (induced fit). Oddziaływania białko – ligand mogą mieć charakter regulacyjny i zmniejszać oddziaływania z innymi ligandami
§ W multimerycznych białkach konforma-cyjne (wywołane wiązaniem liganda) zmiany w jednej podjednostce prowadzić mogą do zmian konformacyjnych w innych podjednostkach
§ Wiązanie tlenu przez mioglobinę i hemoglobinę jest klasycznym przypadkiem oddziaływania białko – ligand
§ Tlen jest słabo rozpuszczalny w wodzie i nie może być transportowany w wystarczających do metabolizmu ilościach przez płyny ustrojowe. Bezpośrednia dyfuzja do tkanek zewnętrznych jest efektywna tylko na dystansie kilku milimetrów. Ewolucja doprowadziła do powstania białek zdolnych do wiązania i przenoszenia tlenu – mioglobiny i hemoglobiny. Aminokwasy nie są w stanie wiązać tlenu, rolę tę pełnią w tych białkach metale przejściowe – żelazo i miedź
§ Występowanie żelaza w stanie wolnym wiązałoby się z tworzeniem wolnych rodników – reaktywnych form tlenu mogących uszkadzać inne biomolekuły. Dlatego żelazo związane jest w specyficznej grupie prostetycznej – hemie
§ Hem składa się z protoporfiryny zbudowanej z czterech połączonych ze sobą pierścieni pirolowych (różniących się w różnych porfirynach podstawienia-mi), koordynacyjnie wiążących atom żelaza (Fe2+) czterema wiązaniami leżą-cymi w jednej płaszczyźnie. Wiązania koordynacyjne zapobiegają utlenieniu Fe2+ do Fe3+. Wiązanie O2 przez Fe2+ ma charakter odwracalny, Fe3+ nie wiąże się z tlenem. Trwałe utlenienie żelaza w wolnym hemie prowadzi do powstania hematyny
§ Fe2+ koordynacyjnie związany z czterema azotami pierścienia porfirynowego ma jeszcze dwa „wolne” wiązania koordynacyjne skierowane prostopadle (w górę i w dół płaszczyzny pozostałych czterech wiązań koordynacyjnych). W białkach wiążących tlen jedno z tych wiązań wiąże azot pierścienia imidazolowego histydyny z łańcucha polipeptydowego (tzw. proksymalna HisF8), drugie może wiązać tlen cząsteczkowy (O2)
§ Wiązanie tlenu prowadzi do zmian elektronowych atomu hemowego żelaza objawiających się zmianą koloru (np. krew żylna z małą ilością tlenu – ciemnopurpurowa, utlenowana krew tętnicza – jasnoczerwona
§ Niektóre cząsteczki (CO i NO) koordynują żelazo hemowe efektywniej niż tlen. Wiązanie CO prowadzi do wypierania O2 z hemu. Aby temu przeciwdziałać białka wiążące tlen otaczają i chowają pierścień hemowy wewnątrz swojej struktury
§ Mioglobina i hemoglobina wiążą tlen w różny sposób ze względu na różnice strukturalne między nimi. Mioglobina jako białko monomeryczne z jedną prostetyczną grupą hemową ma typową dla prostych oddziaływań białko – ligand hiperboliczną krzywą nasycenia tlenem. Hemoglobina jest tetramerem z czterema grupami hemowymi, jej krzywa nasycenia tlenem ma charakter sigmoidalny, ze względu na kooperatywne oddziaływanie podjednostek
§ Mioglobina – białko magazynujące tlen ma do niego większe powinowactwo niż hemoglobina. Wiązanie tlenu przez mioglobinę pozwala na dostarczanie go mięśniom przy intensywnym wysiłku. Hemoglobina – przenosi tlen z płuc gdzie jego ciśnienie parcjalne jest duże (ok. 100 mm Hg) do naczyń włosowatych, gdzie ciśnienie parcjalne tlenu jest niższe (ok. 40 mm Hg), co prowadzi do częścio-wej desaturacji oksyhemoglobiny
§ Mioglobina jest pojedynczym łańcuchem polipeptydowym. Hemoglobina jest tetramerem typu a2b2. Każdy z łańcuchów ma konformację identyczną z mioglobiną. Łańcuch polipeptydowy zbudowany jest z ośmiu a-helis opisanych, poczynając od N-końca, literami A do H. Helisy liczące od 7 do 26 reszt aminokwa-sowych powiązane są krótkimi nieregularnie uformowanymi fragmenta-mi łańcucha nazywanymi od łączonych helis regionami AB do GH. Pojedyncze reszty aminokwasowe oznaczone są według zajmowanej pozycji w określo-nym fragmencie struktury drugorzędo-wej, np. HisF8
§ Mioglobina pozbawiona tlenu (deoksymioglobina) po związaniu tlenu przechodzi w oksymioglobinę. Wiążąca się z hemem mioglobiny cząsteczka tlenu ustawia się pod kątem 60o do płaszczyzny hemu. Ułatwia to oddziaływanie między dystalną HisE7 (z helisy E) a tlenem. Tłumaczy to też słabsze powinowactwo CO do hemu związanego z mioglobiną niż do wolnego hemu (dla wolnego hemu powinowactwo do CO jest 250 000 razy większe niż dla tlenu, dla związanego hemu tylko 250 razy). Preferująca prostopadłe ustawienie do płaszczyzny hemu cząsteczka CO zmuszona jest do zmiany ustawienia przez HisE7 (co zmniejsza powinowac-two)
§ Związanie cząsteczki tlenu zmienia usytuowanie atomu żelaza w stosunku do płaszczyzny hemu. W deoksy-mioglobinie jon Fe2+ znajduje się o 0.055 nm ponad płaszczyzną hemu w kierunku HisF8. Po przyłączeniu tlenu atom Fe2+ cofa się w kierunku płaszczyzny o 0.029 nm
§ Dwa typy łańcuchów (a i b) w hemo-globinie umożliwiają kooperatywne wiązanie tlenu. Łańcuch a (141 reszt) ma krótszą w porównaniu z mioglobiną C-końcową helisę H i pozbawiony jest helisy D. Łańcuch b (146 reszt) jest również nieco krótszy od mioglobiny (153 reszty), głownie z powodu krótszej C-końcowej helisy H. Łańcuch a kontaktuje się głównie z łańcuchem b, tworząc podjednostkę ab. Kontakty w obrębie podjednostki ab, zwane kontaktami pakującymi (upakowują podjednostkę) nie ulegają zmianie w trakcie przejścia deoksyhemoglobiny w oksyhemoglobinę. Kontakty między dimerami (a1-b2 i a2-b1), zmieniające się w procesie utlenowania, zwane są kontaktami ślizgającymi się. Dimery rotują wokół osi o 15o
§ Żelazo w hemach hemoglobiny (podobnie jak w mioglobinie) wystaje o ok. 0.06 nm ponad płaszczyznę hemu. Wiąże się to z oddziaływaniami między proksymalną HisF8 a atomami azotu pierścienia porfirynowego oraz odpychaniem miedzy elektronami jonu Fe2+ a elektronami p porfiryny. Po przyłączeniu tlenu atom żelaza przybliża się o 0.039 nm do płaszczyzny hemu (wystaje więc od niej tylko na 0.021 nm). Powoduje to przyciąganie do płaszczyz-ny hemu HisF8 razem z helisą w której ta histydyna występuje (helisa F wraz ze zgięciami EF i FG). Konsekwencją tej zmiany konformacyjnej jest zerwanie oddziaływań wodorowych i mostków solnych między podjednostkami oraz przemieszczenie się podjednostek względem siebie. Kluczowe rozerwane wiązanie wodorowe to TyrHC2 (Tyra140, Tyrb145) – ValFG5 (Vala93, Valb98). Pęka osiem mostków solnych (dwa wewnątrzłańcuchowe, sześć międzyłań-cuchowych). Spośród międzyłańcucho-wych dwa dotyczą połączeń między N a C końcem a1 i a2 łańcuchów, dwa – połączeń między C-końcami łańcuchów b1 i b2 a N-końcami łańcuchów a2 i a1, dwa między resztami Arg i Asp łańcuchów a1 i a2. Po zerwaniu tych oddziaływań następuje przejście z formy T (tense) w jakiej znajduje się deoksyhemoglobina w formę R (relaxed) w jakiej występuje oksyhemoglobina
§ W stanie T tlen dostępny jest tylko dla hemów w łańcuchach a, przejście w stan R udostępnia tlenowi również hemy łańcuchów b. Na tym polega alloste-ryczność – kooperatywne wiązanie tlenu przez podjednostki hemoglobiny
§ Białko przenoszące tlen musi efektywnie wiązać tlen w płucach, gdzie jest go dużo i zwalniać tlen w tkankach gdzie jest go mniej. Nie spełnia tego warunku mioglobina, która ma wysokie, stałe powinowactwo do tlenu i jej krzywa zależności nasycenia tlenem od stężenia tlenu w otoczeniu ma charakter hiperboliczny. Podjednostkowa budowa hemoglobiny oraz występowanie dwóch konformacji: T – o niskim powinowactwie do tlenu i R – o wysokim powinowactwie sprawiają, że krzywa zależności nasycenia tlenem ma dla hemoglobiny charakter sigmoidalny. Pierwsza cząsteczka tlenu reagująca z hemoglobiną wiąże się z nią słabo (wiązanie ze stanem T). Następująca indukcja konformacji R przyspiesza wiązanie kolejnych cząsteczek tlenu. Ostatnia (czwarta) cząsteczka O2 wiąże się z dużym powinowactwem z hemem podjednostki znajdującej się w stanie R
§ Mamy tu do czynienia ze zjawiskiem allosterii – wiązanie liganda z jednym miejscem wiążącym zmienia właściwości innych miejsc wiążących w tej samej cząsteczce białka
§ Ligand zmieniający w ten sposób własności białka nosi nazwę modulatora. Modulacja może powodować zwiększenie lub zmniejszenie aktywności białka. Modulatory allosterycznych białek mogą więc być aktywatorami lub inhibitorami. Jeśli normalny ligand i modulator są identyczne – allosteria ma charakter homotropowy, kiedy normalny ligand i modulator są różne – allosteria jest heterotropowa. Niektóre białka alloste-ryczne mają kilka modulatorów
§ Kooperatywność wiązania tlenu przez hemoglobinę opisuje równanie Hilla:
gdzie Q równa jest stosunkowi miejsc wiążących wypełnionych przez ligand do całkowitej ilości miejsc wiążących, [L] – stężenie liganda, Kd = stała dysocjacji liganda (Kd=[P][L]/[PL]), [P] = stężenie białka, n = ilość miejsc wiążących
§ Zależność log(Q/1-Q) od log[L] nosi nazwę krzywej Hilla. Eksperymentalnie wyznaczone nachylenie krzywej charakteryzuje się współczynnikiem Hilla (nH) równym tangensowi kąta nachylenia krzywej i jest miarą stopnia koopera-tywności między miejscami wiążącymi. Jeśli nH jest równy 1 (jak dla mioglobiny) wiązanie liganda nie jest kooperatywne, jeśli jest większy od 1 – mamy do czynienia z kooperatywnością
§ Istnieją dwa modele oddziaływań allosterycznych (kooperatywnego wiąza-nia ligandu): model jednoprzejściowy i model sekwencyjny
§ W modelu jednoprzejściowym (MWC od nazwisk Monod, Wyman i Changeux) zakłada się, że podjednostki w białku występują w jednej z dwu możliwych konformacji (R lub T). Wszystkie podjed-nostki są zawsze w jednej formie (R lub T), nie występują konformacje mieszane (RT). Ligand wiązać się może z każdym typem konformacji, z tym że jego powinowactwo do formy T jest małe, do formy R – duże. Wiązanie każdego liganda zwiększa prawdopodobieństwo, że wszystkie podjednostki występują w formie R. Przemiana allosteryczna ma charakter jednoprzejściowy – zmiana konformacji z T na R zachodzi równo-cześnie we wszystkich podjednostkach
§ W modelu sekwencyjnym (Koshland, Nemethy i Filmer) wiązanie liganda zmienia konformację pojedynczej podjednostki, pozostając bez wpływu na konformację sąsiadujących podjednos-tek, powiększa jednak ich powinowactwo do liganda.
§ Protony i dwutlenek węgla zmieniają powinowactwo hemoglobiny do tlenu. Deoksyhemoglobina ma większe powi-nowactwo do protonów niż oksyhemo-globina. Obniżenie pH (zwiększenie stężenia protonów) prowadzi do dysocjacji O2 z hemoglobiny
HBO2 + H+ D HBH+ + O2
Zjawisko to nosi nazwę efektu Bohra. Protony wiązane są przez His146 (HisHC3) w b podjednostkach. Po protonacji two-rzą się pary jonów z Asp94 (AspFG1) – pomaga to w stabilizacji deoksyhemo-globiny w konformacji T. Wiązanie CO2 również zmniejsza powinowactwo hemoglobiny do O2. Jako rezultat oddy-chania komórkowego powstaje CO2. Ulega on we krwi uwodnieniu (przez działanie anhydrazy węglanowej) do dwuwęglanu. Wydzielają się przy tym protony, co prowadzi do oddysocjowania tlenu od hemoglobiny
CO2 + H2O D H2CO3 D H+ + HCO3-
Jony dwuwęglanowe transportowane są z krwią do naczyń włosowatych płuc. Wiązanie tlenu przez hemoglobinę powoduje zwalnianie protonów. Te reagują z HCO3- tworząc H2CO3, z którego uwalnia się CO2 wydalany następnie z płuc jako gaz. Część CO2 transportowana jest z tkanek do płuc bezpośrednio przez hemoglobinę w formie karbaminianu. Wolne grupy a-aminowe na N-końcach podjednostek wiążą się odwracalnie z CO2
R-NH2 + CO2 D R-NH-COO- + H+
Reakcja napędzana jest w prawo przez wysokie stężenie CO2 w tkankach. W płucach, gdzie stężenie CO2 jest niskie, reakcja przebiega w odwrotnym kierunku. Karbamylacja N-końców powoduje tworzenie mostków solnych z Arg141, co stabilizuje T konformację hemoglobiny
§ Powinowactwo hemoglobiny do tlenu zmniejsza także 2,3-bisfosfoglicerynian (BPG) obecny w erytrocytach. BPG ma inne miejsce wiązania niż O2 i reguluje powinowactwo hemoglobiny do O2 zależnie od ciśnienia parcjalnego tlenu (pO2) w płucach. Odgrywa to znaczną rolę przy fizjologicznej adaptacji ludzkiego organizmu do dużych wysokości. Na poziomie morza ilość tlenu dostarczana do tkanek wynosi 38% maksymalnej pojemności hemoglobiny. Na dużych wysokościach pO2 jest niższe, co zmniejsza ilość tlenu dostarczanego tkankom (np. na 4500 m do 30% pojemności Hb). Po kilku godzinach na tej wysokości wzrasta stężenie BPG w erytrocytach (z 5 mM do 8 mM), rezultatem tego jest obniżenie powinowactwa Hb do O2. Ma to niewielkie znaczenie dla wiązania tlenu w płucach, zwiększa jednak znacznie oddawanie O2 przez Hb w tkankach i prawie przywraca pierwotną równowagę. Ujemnie naładowany BPG wiąże się z dodatnio naładowanymi resztami aminokwasowy-mi b łańcuchów w centralnym zagłę-bieniu na styku podjednostek (1 mol BPG na 1 mol tetrameru Hb). Stabilizuje to konformację T. Przejście w stan R likwiduje wolną przestrzeń między podjednostkami i uniemożliwia wiązanie BPG.
§ Regulacja siły wiązania tlenu przez Hb w obecności BPG odgrywa znaczną rolę w rozwoju płodowym. Płód uzyskuje tlen z krwi matki, jego Hb musi więc mieć większe powinowactwo do tlenu niż matczyna hemoglobina. W płodowej hemoglobinie zamiast łańcuchów b występują łańcuchy g (struktura a2g2). Łańcuchy g mają zamiast dodatnich reszt His 143 obojętne reszty Ser. Zmniejsza to znacznie powinowactwo płodowej Hb do BPG, zwiększając tym samym jej powinowactwo do O2.
§ Istnieje więcej niż 300 genetycznych wariantów hemoglobiny. Większość z nich polega na pojedynczych różnicach w sekwencji aminokwasowej podjed-nostek. Warianty te są czasem przyczyną poważnych schorzeń, np. anemii sierpowatej. Występuje tu hemoglobina S, w której w łańcuchach b Glu6 zastąpiona została przez Val. Zmniejsza to ujemny ładunek hemoglobiny S w porównaniu z normalną hemoglobiną A i prowadzi do powstawania hydrofobo-wego pasma na powierzchni cząsteczki. Rezultatem tego jest agregacja hemoglobiny S. Powstające nitkowate agregaty deformują erytrocyty, nadając im sierpowaty kształt. Krwinki te łatwo ulegają uszkodzeniu, co prowadzi do anemii. Nietypowy kształt erytrocytów powoduje zatory w naczyniach włoso-watych. Choroba kończy się zwykle śmiercią w dzieciństwie. Występuje tylko u homozygot. Mutacja utrzymuje się w populacjach ludzkich występujących w rejonach malarycznych, ponieważ zmutowane osobniki są odporne na malarię.
Immunoglobuliny
§ Wszystkie kręgowce mają system immunologiczny zdolny do rozróżniania „swego” od „obcego” i niszczący związki chemiczne czy komórki uznane za obce. System immunologiczny tworzą różnego typu leukocyty różnicujące się z komórek pnia szpiku kostnego. Leukocyty (makrofagi, granulocyty i limfocyty) patrolują system krwionośny i tkanki, produkując białka zdolne do rozpoznania i związania infekujących cząsteczek.
§ Odpowiedź immunologiczna dzieli się na humoralną (skierowaną przeciw infekcjom bakteryjnym, zewnątrzkomór-kowym wirusom i białkom wprowadzo-nym do organizmu) i komórkową (niszczącą komórki zainfekowane wirusami, obce tkanki i pasożyty). W odpowiedzi humoralnej zasadniczą rolę odgrywają stanowiące 20% całkowitych rozpuszczalnych białek krwi immuno-globuliny (przeciwcia...
xyzgeo