26. Spalik, Piwczynski, Rekonstrukcja filogenezy i wnioskowanie filogenetyczne w badaniach ewolucyjnych (2009)(1).pdf

Tom 58 2009

Numer 3–4 (284–285)

Strony 485–498

K rzysztof s paliK 1 , M arcin p iwczyńsKi 2

1 Zakład Systematyki i Geografii Roślin

Instytut Botaniki

Uniwersytet Warszawski

Aleje Ujazdowskie 4, 00-478 Warszawa

2 Zakład Taksonomii i Geografii Roślin

Instytut Ekologii i Ochrony Środowiska

Uniwersytet Mikołaja Kopernika

Gagarina 9, 87-100 Toruń

E-mail: spalik@biol.uw.edu.pl

piwczyn@umk.pl

REKONSTRUKCJA FILOGENEZY I WNIOSKOWANIE FILOGENETYCZNE W BADANIACH

EWOLUCYJNYCH

DARWIN, HAECKEL I FILOGENEZA

W lipcu 1837 r. Darwin naszkicował w

swoim notatniku schematyczny graf rela-

cji pokrewieństwa między gatunkami, ob-

razujący koncepcję drzewa życia. Ta idea,

ubrana w daleko doskonalszą formę gra-

ficzną, pojawiła się także 22 lata później w

jego rewolucyjnym dziele „O powstawaniu

gatunków”, ale wciąż jako koncept, a nie

konkretne drzewo filogenetyczne, przed-

stawiające zależności ewolucyjne między

gatunkami. Nie ma w tym nic dziwnego —

Darwin zajmował się wyjaśnianiem mecha-

nizmów ewolucji, nie zaś odtwarzaniem jej

przebiegu. Pierwsze drzewo filogenetyczne

pojawiło się w „Generelle Morphologie der

Organismen” Ernsta Heackla w 1866 r. i tę

datę można przyjąć jako oficjalny początek

filogenetyki — gałęzi biologii zajmującej się

rekonstrukcją filogenezy organizmów.

Drzewo filogenetyczne Haeckla było za-

pisem poglądów tego wybitnego uczonego

na pochodzenie organizmów i podsumowa-

niem ówczesnego stanu wiedzy. Jednocze-

śnie było hipotezą naukową, podlegającą

weryfikacji w toku dalszych badań. Jeśli po-

patrzymy na zapisane na nim zależności filo-

genetyczne, to okaże się, że niewiele z nich

zostało poprawnie odtworzonych, a obecny

obraz drzewa życia jest zasadniczo odmien-

ny. Jednak drzewo filogenetyczne nadal po-

zostaje jednocześnie podsumowaniem obec-

nego stanu wiedzy oraz hipotezą badawczą.

W filogenetyce, podobnie jak w każdej na-

uce przyrodniczej, nie ma prawd absolut-

nych, a teorie i hipotezy uznajemy za praw-

dziwe, jeśli nikomu, mimo usilnych prób,

nie udało się ich obalić. Warto pamiętać o

tym zakresie niepewności, jaki towarzyszy

wszystkim prawdom naukowym, a zwłaszcza

dotyczącym odtwarzania przeszłości.

W tym artykule chcielibyśmy skupić się

na metodyce badań filogenetycznych, a tak-

że pokazać, w jaki sposób otrzymane filo-

genezy służą wnioskowaniu ewolucyjnemu.

Chcemy pokazać, że analizy filogenetyczne

bazujące na danych molekularnych, aczkol-

wiek obarczone, jak w wypadku wszystkich

nauk historycznych, nieuniknioną niepew-

nością, wsparte są na solidnych podstawach

naukowych, a wypływające z nich wnioski

nie są gorszej jakości od wniosków z badań

eksperymentalnych.

486

K rzysztof s paliK , M arcin p iwczyńsKi

Dwa poDEJŚcia Do KonstrUowania DrzEwa

Istnieje zasadnicza różnica metodologicz-

na między drzewem Haeckla a współczesny-

mi przedstawieniami filogenezy. To pierwsze

było po prostu wyrazem poglądów badacza,

wspartych wprawdzie rzetelną wiedzą i wy-

nikającą z niej intuicją, ale nie powstało ono

w wyniku żadnych określonych procedur.

Współczesne drzewa są natomiast usyskiwa-

ne za pomocą określonych algorytmów ob-

liczeniowych. Wyniki są zobiektywizowane

i powtarzalne, a tym samym weryfikowalne.

Ten przełom w filogenetyce został dokona-

ny dzięki rozwojowi metod numerycznych

oraz wynalezieniu komputerów, a przyniósł

go nurt taksonomii zwany fenetyką, której

„ojcami-założycielami” byli P. H. A. Sneath i

R. R. Sokal. Jest paradoksem, że fenetyka jed-

nocześnie odrzuciła biologiczny sens odtwa-

rzania drzewa życia, a skoncentrowała się na

konstruowaniu zależności wszechstronnego

podobieństwa między organizmami, zakłada-

jąc, że drzewo filogenetyczne wyjdzie mimo-

chodem. Nie czyniła ona żadnych założeń o

przydatności cech, traktując je równocennie.

Odmienne podejście prezentowała klady-

styka, której prekursorem był Willi Hennig.

Ostro krytykowała ona podejście fenetyczne

wskazując, że o pochodzeniu od wspólnego

przodka świadczą jedynie wspólne unikato-

we cechy pochodne ewolucyjnie, czyli sy-

napomorfie, nie zaś cechy homoplastyczne:

pierwotne ewolucyjnie, odziedziczone po od-

ległym przodku (symplezjomorfie) albo po-

wstałe niezależnie (parallelizmy). Rozróżnia

się synapomorfie od homoplazji posługując

się zasadą parsymonii (oszczędności), czyli

wybierając spośród wszystkich możliwych

drzew takie, które wyjaśnia różnorodność

cech na liściach drzewa za pomocą najmniej-

szej liczby zmian na gałęziach, minimalizując

tym samym konflikty cech. Spór między fe-

netyką a kladystyką był niezwykle gwałtow-

ny — dziś emocje opadły, a w efekcie status

obywatelstwa we współczesnej filogenetyce

zyskały sobie koncepcje z obu nurtów. Nikt

dzisiaj nie kwestionuje, że nadrzędnym pro-

blemem badawczym jest rekonstrukcja filoge-

nezy, ale ten cel jest osiągany również za po-

mocą metod bazujących na podobieństwie.

rEwolUcJa MolEKUlarna w filoGEnEtycE

Biologia molekularna, a przede wszyst-

kim rozwój metod łańcuchowej reakcji poli-

merazy (PCR) oraz sekwencjonowania DNA,

zrewolucjonizowała odtwarzanie drzewa ro-

dowego organizmów. Dane z sekwencji oka-

zały się daleko lepszymi znacznikami dla re-

konstrukcji filogenezy niż tradycyjne cechy

morfologiczne, anatomiczne czy biochemicz-

ne. Składa się na to kilka powodów. Przede

wszystkim, dane z sekwencji są genetyczne

— przedstawiają nam od razu zapis informa-

cji w DNA (lub RNA), podczas gdy dane z

budowy organizmów mówią nam o tym zapi-

sie pośrednio. Co gorsza, fenotyp organizmu

jest wypadkową informacji genetycznej oraz

jego interakcji ze środowiskiem zewnętrz-

nym, a określona cecha morfologiczna może

być determinowana przez jeden albo przez

wiele loci. Wnioskowanie o podłożu gene-

tycznym określonej cechy morfologicznej na

podstawie jej zmienności jest zatem obarczo-

ne dużym błędem. Co więcej, aby taką cechę

wykorzystać w analizie komputerowej, mu-

simy jej zmienność zakodować, czyli przed-

stawić w formie liczb lub znaków, a sposób

tego kodowania jest z konieczności arbitral-

ny — natomiast dane z sekwencji nie wyma-

gają kodowania, ponieważ są już zapisane

jako ciąg znaków.

Sekwencje DNA dają nam też niezwykłą

możliwość porównywania ze sobą bardzo

odległych ewolucyjnie organizmów. Przy-

kładowo — trudno na podstawie morfologii

czy anatomii szacować odległość ewolucyjną

między człowiekiem a bakterią Escherichia

coli , ich budowa jest bowiem zbyt odmienna

i trudno wskazać jakiekolwiek porównywal-

ne cechy. Mają one jednak wiele podobnych

genów, np. loci, w których są zapisane se-

kwencje rybosomalnego DNA. Dzięki takim

genom możliwe jest stworzenie kompletnego

drzewa życia.

Dla odtwarzania filogenezy nie bez zna-

czenia jest sposób, w jaki utrwaliły się anali-

zowane zmiany cech (mutacje). Procesy pro-

wadzące do rozpowszechnienia się mutacji

możemy podzielić na dwa rodzaje: determi-

nistyczne oraz stochastyczne (losowe). Proce-

sem deterministycznym jest dobór naturalny

— mutacje korzystne zwiększają swój udział

w puli genowej, natomiast niekorzystne są z

niej eliminowane (patrz rozdział Ł oMnicKiE -

Rekonstrukcja filogenezy

487

Go Dobór naturalny w tym zeszycie KOSMO-

SU). Dobór naturalny jest architektem ewolu-

cji, odpowiedzialnym za różnorodność orga-

nizmów. Paradoksalnie jednak, cechy utrwa-

lone wskutek działania doboru mogą być

zawodne w odtwarzaniu przebiegu ewolucji,

silny nacisk selekcyjny sprzyja bowiem zmia-

nom homoplastycznym — konwergencjom. W

filogenetyce bardziej przydatne są cechy, któ-

re utrwaliły się przypadkowo, jest bowiem

mało prawdopodobne, że taka sama przypad-

kowa zmiana utrwali się ponowne. Gdzie ta-

kich cech szukać? Fenotyp organizmu podle-

ga silnej presji środowiska, a zatem zdecydo-

wana większość cech fenotypowych musiała

przejść przez sito doboru. Inaczej jest na po-

ziomie genetycznym. Kiedy poznano sekwen-

cje genów, zauważono dużą liczbę mutacji

milczących, czyli niezmieniających sekwencji

kodowanego białka; jeszcze więcej mutacji

stwierdzono w sekwencjach niekodujących,

np. w przestrzeniach międzygenowych albo

w intronach. Spostrzeżenia te zaowocowały

sformułowaniem neutralnej teorii ewolucji,

której autorem był japoński badacz Motoo

Kimura (patrz też artykuł Ł oMnicKiEGo Dryf

genetyczny w tym zeszycie KOSMOSU). Za-

kłada ona, że większość substytucji (mutacji

punktowych) jest neutralna lub prawie neu-

tralna dla organizmu oraz że ich utrwalenie

w populacji jest procesem przypadkowym.

Ponieważ procesy powstawania i utrwalania

mutacji są stochastyczne, to różnice między

sekwencjami tego samego odcinka DNA u

różnych organizmów są funkcją czasu, jaki

upłynął od rozejścia się prowadzących do

nich linii filogenetycznych. Umożliwia to nie

tylko samo oszacowanie filogenezy, ale także

— przy spełnieniu dodatkowych warunków

— na opisanie tej filogenezy za pomocą skali

czasu (patrz artykuł J ErzManowsKiEGo w tym

zeszycie KOSMOSU).

filoGEnEtyKa MolEKUlarna a traDycyJna taKsonoMia

„Inwazja” metod molekularnych do takso-

nomii oraz tradycyjnej filogenetyki bazującej

na cechach morfologicznych nie odbyła się

bez oporów. Wnioski płynące z badań mole-

kularnych były rewolucyjne, obalały bowiem

wiele głęboko zakorzenionych poglądów na

relacje pokrewieństwa między organizmami.

Niekiedy tradycyjnym taksonomom trudno

było się pogodzić z tymi wnioskami, a także z

tym, że badania molekularne w krótkim czasie

dały odpowiedź na pytania, nad którymi oni

biedzili się przez całe życie. Nieufność do wy-

ników badań molekularnych pogłębiały błędne

oznaczenia gatunków w niektórych analizach

(biolodzy molekularni nie zadali sobie trudu

zweryfikowania użytego do badań materiału)

oraz niestabilność kladów (gałęzi drzewa) spo-

wodowana niedostatecznym próbkowaniem

taksonomicznym (liczba taksonów) i genetycz-

nym (reprezentatywność i długość sekwencji).

Ponadto, dało się zauważyć pewną nonszalan-

cję taksonomów molekularnych, połączoną z

naiwną wiarą, że drzewo molekularne jest od-

powiedzią na wszystkie pytania. Wkrótce jed-

nak okazało się, że drzewo molekularne jest

nie tyle końcem, co początkiem badań — trze-

ba bowiem je zinterpretować i sprawdzić, czy

istotnie odpowiada na jakiekolwiek pytania

ewolucyjne. Dziś już oba nurty — molekular-

ny i morfologiczny — zgodnie koegzystują w

taksonomii i biologii ewolucyjnej, korzystając

wzajemnie z uzupełniających się kompetencji.

Do absolutnych wyjątków należy kwestiono-

wanie wyników badań molekularnych, jak to

ostatnio uczynili G rEhan i s chwartz (2009),

postulując na podstawie zaledwie kilkudzie-

sięciu cech morfologicznych, a wbrew bada-

niom molekularnym, że najbliższym krewnym

człowieka jest orangutan, a nie szympans. Ich

krytyka filogenetyki molekularnej jest naiwna

i świadczy o podstawowych brakach w wie-

dzy — odrzucają oni bowiem wyniki analiz

molekularnych twierdząc, że podobieństwo

molekularne nie świadczy o pokrewieństwie,

ustalenie homologii jest wątpliwe, a morfo-

logia jest bardziej stabilna ewolucyjnie. Ab-

solutne zdumienie budzi fakt, że artykuł ten

został opublikowany w bardzo prestiżowym

czasopiśmie, jakim jest Journal of Biogeogra-

phy. Jednak towarzyszący mu komentarz od

redakcji świadczy, że głównym powodem pu-

blikacji była raczej „polityczna poprawność”

— oddanie głosu zanikającej mniejszości — a

sami redaktorzy mają świadomość, iż dla każ-

dego biologa molekularnego albo taksonoma

lub antropologa choćby nieco obeznanego z

filogenetyką molekularną wnioski autorów są

nonsensowne. Filogenetyka molekularna to

jednak coś więcej niż prosta analiza podobień-

stwa molekularnego, co oczywiście nie znaczy,

że wnioskowanie filogenetyczne na podstawie

danych molekularnych jest zawsze bezbłęd-

ne i nieobarczone niepewnością. Warto sobie

uświadomić źródła tej niepewności.

488

K rzysztof s paliK , M arcin p iwczyńsKi

hoMoloGia sEKwEncJi i syGnaŁ filoGEnEtyczny

Porównując te same sekwencje DNA

otrzymane od osobników z różnych popula-

cji lub z różnych gatunków możemy oczeki-

wać, że bliżej spokrewnione będą osobniki

(gatunki), które różnią się mniejszą liczbą

mutacji. Czy zatem wnioskowanie o pokre-

wieństwach między organizmami jest pro-

stym zabiegiem polegającym na porównaniu

sekwencji i obliczeniu liczby różniących je

podstawień? Sytuacja nie jest tak prosta, a

droga do odtworzenia filogenezy jest pełna

pułapek. Po pierwsze, sekwencje wybrane do

analizy powinny być homologiczne, czyli po-

chodzące od wspólnego przodka. Homologia

na poziomie sekwencji ma jednak dwojakie

oblicze. Sekwencje ortologiczne zajmują ten

sam locus i ewoluują niezależnie od czasu

rozejścia się linii filogenetycznych, czyli od

specjacji. To one niosą sygnał filogenetyczny

— zapis historii ewolucyjnej danej linii ewo-

lucyjnej. W trakcie ewolucji regularnie wy-

stępują jednak także duplikacje loci (patrz

artykuł J ErzManowsKiEGo w tym zeszycie KO-

SMOSU), w wyniku czego powstają sekwen-

cje paralogiczne. Pomieszanie sekwencji or-

tologicznych i paralogicznych uniemożliwia

odtworzenie prawidłowej filogenezy, ponie-

waż sekwencje paralogiczne ewoluują nieza-

leżnie od momentu duplikacji locus, a nie od

rozejścia się linii filogenetycznych.

Wybór sekwencji ortologicznych nie gwa-

rantuje jednak, że informacja o ich historii

ewolucyjnej jest niezaburzona. Procesami,

które powodują, że sekwencje są do siebie

bardziej podobne, niżby to wynikało z czasu,

który upłynął od ich rozejścia się, są:

— mutacje wsteczne (rewersje), czyli po-

wrót do nukleotydu występującego w se-

kwencji u wspólnego przodka;

— wielokrotne podstawienia, czyli kilku-

krotne zamiany nukleotydów w tym samym

miejscu, wskutek czego obserwujemy mniej

podstawień, niż ich w rzeczywistości było;

— podstawienia równoległe, czyli nieza-

leżne podstawienia w tej samej pozycji przez

ten sam nukleotyd w obu porównywanych

sekwencjach.

Wszystkie te procesy zaburzają liniową

zależność między czasem rozejścia się organi-

zmów a liczbą obserwowanych mutacji oraz

zacierają sygnał filogenetyczny, czyli mutacje

synapomorficzne, dzięki którym można zi-

dentyfikować pokrewieństwo gatunków.

Bardzo istotnym problemem jest także

zidentyfikowanie homologicznych pozycji w

sekwencji, czyli dokonanie ich przyrównania.

Nie zawsze jest to zadanie łatwe, ponieważ

w trakcie ewolucji zachodzą nie tylko pod-

stawienia nukleotydów, ale także ich insercje

(wstawienia) i delecje (usunięcia). W wy-

padku sekwencji kodujących białka insercje

i delecje są zazwyczaj usuwane przez dobór

oczyszczający, albowiem wstawienie bądź

usunięcie jednego lub dwóch nukleotydów

zmienia odczyt, wskutek czego białko prze-

staje być funkcjonalne. Jedynie wstawienia

trzech (albo wielokrotności trzech) nukle-

otydów mają szansę na przejście przez sito

doboru. Natomiast w sekwencjach niekodu-

jących, np. w intronach lub przestrzeniach

międzygenowych, delecje i insercje zdarzają

się często. Proces przyrównywania sekwen-

cji jest kluczowy do właściwego oszacowania

pokrewieństw między organizmami żywymi

i obecnie istnieje wiele algorytmów umożli-

wiających dokonanie takiego przyrównania.

UKorzEnianiE DrzEwa

Przyjrzyjmy się strukturze drzewa filoge-

netycznego jako zapisowi relacji pokrewień-

stwa ewolucyjnego między organizmami.

Drzewo to zbudowane jest z węzłów — ze-

wnętrznych i wewnętrznych — i łączących je

gałęzi (Ryc. 1). W drzewie w pełni rozwiąza-

nym każdy węzeł wewnętrzny połączony jest

z innymi węzłami za pomocą trzech gałęzi,

zaś do węzłów zewnętrznych prowadzi tylko

jedna. W drzewie nie w pełni rozwiązanym

gałęzi wychodzących z jednego węzła może

być więcej, czyli występują politomie. Węzły

zewnętrzne nazywamy inaczej liśćmi; każdy z

nich odpowiada badanemu organizmowi. Na-

tomiast węzły wewnętrzne można przypisać

hipotetycznym wspólnym przodkom okre-

ślonych konarów (kladów) drzewa. Drzewo

zrekonstruowane metodami filogenetyczny-

mi jest zazwyczaj drzewem niezakorzenio-

nym, a więc takim, w którym nieznany jest

kierunek ewolucji. Innymi słowy, nie wiemy,

która z tych trzech gałęzi wchodzi do dane-

Rekonstrukcja filogenezy

489

Rycina 1. Struktura drzewa niezakorzenionego

(1) i zakorzenionego (2).

Oba drzewa mają tę samą topologię. A, B, C, D ozna-

czają liście, czyli węzły zewnętrzne drzewa, zaś E, F

i G — węzły wewnętrzne, przy czym drzewo (2) jest

ukorzenione w węźle G. Strzałki przy drzewie za-

korzenionym wskazują kierunek ewolucji, w przeci-

wieństwie do drzewa niezakorzenionego, w którym

kierunek ten jest nieznany.

go węzła, a które z niego wychodzą (Ryc. 1).

Ukorzenienie polega na dodaniu dodatko-

wego węzła na jednej z gałęzi, tożsamego ze

wspólnym przodkiem wszystkich badanych

organizmów. Innymi słowy, łamiemy tę ga-

łąź na dwie oraz do miejsca złamania (węzła)

dołączamy korzeń drzewa. Po ukorzenieniu

drzewa możemy zauważyć, że zmienia się

status gałęzi w węzłach. W drzewie niezako-

rzenionym wszystkie trzy gałęzie zbiegające

się w węźle wewnętrznym są równocenne,

natomiast w drzewie zakorzenionym jedna z

nich jest gałęzią wchodzącą, a dwie wycho-

dzącymi. Grupy wywodzące się z jednego

węzła nazywamy siostrzanymi. Warto zauwa-

żyć, że bez ukorzenienia drzewa nie możemy

wyciągać żadnych sensownych wniosków o

ewolucji badanej grupy, np. o monofilety-

zmie określonych taksonów albo o kierunku

zmian morfologicznych.

Najlepszym sposobem ukorzenienia drze-

wa jest uwzględnienie w analizie filogene-

tycznej nie tylko badanej grupy, ale także jej

najbliższych krewnych, czyli tzw. grupy ze-

wnętrznej. Odszukujemy na uzyskanym drze-

wie wspólny wewnętrzny węzeł dla badanej

grupy i wspólny wewnętrzny węzeł dla gru-

py zewnętrznej, a następnie przełamujemy łą-

czącą je gałąź. Przykładowo, wiemy z innych

badań, że grupą siostrzaną roślin okrytoza-

lążkowych są nagozalążkowe. Rekonstruując

filogenezę okrytozalążkowych, wybieramy

więc sekwencje jednego lub kilku nagoza-

lążkowych, np. sosny, sagowca, miłorzębu

lub welwiczji, jako przedstawicieli grupy ze-

wnętrznej. Następnie na drzewie odszuku-

jemy gałąź łączącą okryto- i nagozalążkowe

i przełamujemy ją, dodając korzeń. Dzięki

takiemu zabiegowi jesteśmy w stanie stwier-

dzić, w jakiej kolejności oddzielały się po-

szczególne linie rodowe okrytozalążkowych

i która grupa współczesnych gatunków jest

filogenetycznie najstarsza. Ukorzenianie drze-

wa za pomocą grupy zewnętrznej jest stan-

dardową procedurą w badaniach filogene-

tycznych. Warto jednak zauważyć, że błędne

wybranie grupy zewnętrznej, a tym samym

błędne zakorzenienie, sprawia, że błędnie

odczytujemy na nim kierunek ewolucji.

Wszystkie metody szacowania filogene-

zy dają możliwość obliczenia długości gałęzi

łączących poszczególne węzły. Jeśli długość

gałęzi jest proporcjonalna do liczby mutacji

(obserwowanej lub oszacowanej), które za-

szły między węzłami, to takie drzewo nazy-

wamy filogramem. Natomiast jeśli długość

gałęzi odpowiada czasowi względnemu lub

absolutnemu, wtedy mówimy o chronogra-

mie. Czasami interesuje nas tylko topologia

drzewa (wzór rozgałęzień), a długość gałęzi

jest nieistotna — takie drzewo nazywamy kla-

dogramem.

DrzEwo GatUnKÓw i DrzEwo GEnÓw

Warto zwrócić uwagę, że drzewo filoge-

netyczne odzwierciedla relację między przy-

równanymi sekwencjami, dlatego też jest ono

zawsze drzewem genów. Nie zawsze historia

ewolucyjna genów odpowiada historii gatun-

ków. Mechanizmów prowadzących do takich

niezgodności jest kilka. Najważniejsze to:

— rekombinacja genów paralogicznych

lub rekrutacja pseudogenów, wskutek czego

powstały rekombinowany allel zawiera sygnał

filogenetyczny z dwóch lub więcej loci;

— horyzontalny przepływ genów, czyli

„przeskoczenie” materiału genetycznego z

jednej linii filogenetycznej do drugiej; zjawi-

sko to jest powszechne u bakterii, ale sto-

sunkowo rzadkie wśród eukariotów, choć u

roślin kwiatowych, szczególnie w genomie

mitochondrialnym, znaleziono geny pocho-

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: