(Chemia kombinatoryczna i nowe leki).pdf

Chemia kombinatoryczna

i nowe leki

Nowatorska technika jednoczesnego wytwarzania wielu pokrewnych substancji

rewolucjonizuje sposb odkrywania lekw

Matthew J. Plunkett i Jonathan A. Ellman

pornoæciowy produkuje prze-

ciwcia¸a Ð bia¸ka, ktre wiý si«

z atakujcymi patogenami. Dzi«ki prze-

tasowaniu doæ ograniczonej liczby pod-

stawowych sk¸adnikw mog powsta

biliony rýnych przeciwcia¸. Uk¸ad od-

pornoæciowy nie wytwarza jednak tych

wyspecjalizowanych czsteczek w mo-

mencie zagroýenia. Organizm wybra¸ tu

odmienn taktyk«: sprawdza skutecznoæ

juý istniejcych przeciwcia¸ wobec nowe-

go patogenu, nast«pnie zaæ przyst«puje

do masowej produkcji tych, ktre spisu-

j si« najlepiej. Wraz z innymi badacza-

mi od kilku lat naæladujemy przyrod«,

poszukujc nowych lekw. W procesie

tzw. chemii kombinatorycznej syntety-

zujemy duý liczb« pokrewnych substan-

cji i wy¸awiamy te, ktre maj wartoæ

farmaceutyczn.

Tradycyjna strategia odkrywania le-

kw polega natomiast na poszukiwaniu

choby æladw ýdanej aktywnoæci nie-

mal we wszystkim, co badacz napotka.

Testowane s zatem przerýne zwizki

syntetyczne, a takýe naturalne Ð izolo-

wane z bakterii, roælin i innych rde¸.

Po zidentyfikowaniu dobrze rokujcej

substancji (nazwijmy j wyjæciow) che-

micy pracowicie krok po kroku mody-

fikuj pocztkow struktur«

i badaj chemiczne i biolo-

giczne w¸aæciwoæci nowego

zwizku.

Metoda ta prowadzi cz«sto

do lekw o zadowalajcej sku-

tecznoæci i bezpieczeÄstwie sto-

sowania. Jednak kaýdy niemal

specyfik wymaga gigantycz-

nego wysi¸ku badaczy, ktrzy

wczeæniej musieli przetestowa

i odrzuci tysice innych

zwizkw. Jest to zatem stra-

tegia zabierajca czas i kosz-

towna. Przejæcie od substancji

wyjæciowej do fiolki z lekar-

stwem na aptecznej p¸ce mo-

ýe poch¸on ca¸e lata i setki

milionw dolarw.

Klasyczne procedury ulep-

szono dzi«ki testom przesie-

wowym, szybszym i dok¸ad-

niejszym niý w przesz¸oæci,

a takýe dzi«ki rozwojowi wie-

dzy o wp¸ywie modyfikacji

strukturalnych na biologiczn

aktywnoæ czsteczki. Wraz

z rozwojem medycyny wzra-

sta jednak zapotrzebowanie

na nowe farmaceutyki. Aby

je wynale, naukowcy mu-

sz mie znacznie wi«cej

zwizkw do testowania, jak

rwnieý wi«cej moýliwoæci

wyszukania substancji wyj-

æciowych, ktre b«d wymaga jak naj-

mniej modyfikacji.

Chemia kombinatoryczna odpowia-

da na te potrzeby, pozwalajc na szyb-

k syntez« nawet milionw struktural-

nie pokrewnych czsteczek. Co wi«cej,

nie s to jakieæ dowolne substancje,

lecz te, po ktrych chemik, znajc cechy

elementw wyjæciowych, oczekuje

okreælonych w¸aæciwoæci. Badanie ak-

tywnoæci otrzymywanych produktw

wskazuje, ktre z kombinacji s najtraf-

niejsze. Potencjalne leki szybciej niý kie-

dykolwiek przedtem trafiaj do prb

klinicznych, a koszt ich uzyskania rw-

nieý maleje.

nych. Zak¸adamy, ýe czsteczki z klasy

A i B mog wzajemnie reagowa, tworzc

nowe zwizki typu AÐB. Spodziewamy

si«, ýe niektre z nich mog¸yby si« oka-

za skutecznymi lekami. Procedury che-

mii kombinatorycznej pozwalaj nam z ¸a-

twoæci otrzyma wszystkie moýliwe

kombinacje: A1ÐB1, A1ÐB2, A2ÐB1 i

A2ÐB2.

W rzeczywistoæci chemicy pracuj ze

znacznie wi«ksz liczb czsteczek. Mo-

ýemy na przyk¸ad wybra 30 struktural-

nie pokrewnych zwizkw, ktre ¸czy

obecnoæ grupy aminowej (ÐNH 2 ), oraz

30 innych zawierajcych grup« karboksy-

low (ÐCOOH). Nast«pnie, zapewni-

wszy odpowiednie warunki reakcji,

ãkrzyýujemyÓ kaýd amin« z kaýdym

kwasem karboksylowym. Otrzymujemy

30 x 30 = 900 rýnych kombinacji, zwiz-

kw, ktre b«d amidami (ÐCONHÐ).

Gdybyæmy dodali jeszcze trzeci zestaw

zawierajcy 30 elementw, wwczas

liczba koÄcowych struktur wzros¸aby do

27 tys. (30 x 30 x 30). Uýycie wi«cej niý

30 zwizkw w kaýdym zestawie spo-

wodowa¸oby dalszy bardzo szybki przy-

rost liczby moýliwych kombinacji.

Poszukiwacze lekw maj do dyspo-

zycji dwie podstawowe techniki kombi-

natoryczne. Pierwsza nosi nazw« synte-

zy rwnoleg¸ej; wynalaz¸ j

w po¸owie lat osiemdziesi-

tych H. Mario Geysen zwi-

zany obecnie z Glaxo Well-

come. Geysen stosowa¸ po-

cztkowo sw metod« do

ustalenia, ktry fragment do-

wolnego duýego bia¸ka wi-

ýe si« z przeciwcia¸em. Wy-

tworzy¸ wi«c ca¸ gam«

krtkich fragmentw bia¸-

kowych, czyli peptydw,

poprzez liczne permutacje

aminokwasw (elementw

budulcowych, z ktrych po-

wstaj bia¸ka i peptydy).

Dzi«ki dziesitkom, a cza-

sem setkom reakcji prze-

biegajcych jednoczeænie i

sprawdzaniu, czy uzyskane

peptydy wiý si« z bada-

nym przeciwcia¸em, zdo¸a¸

szybko wy¸owi reaktywne

struktury spoærd ogromnej

liczby czsteczek.

Produkty uzyskiwane te-

chnik syntezy rwnoleg¸ej

powstaj w oddzielnych na-

czyniach reakcyjnych. Aby

u¸atwi sobie zadanie, chemi-

cy stosuj cz«sto tzw. p¸ytk«

mikromiareczkow, plasti-

kowy arkusz z wg¸«bieniami

o pojemnoæci kilku mililitrw

uszeregowanymi w 8 rz«-

Znale w¸aæciw kombinacj«

Sposb tworzenia kombinatorycznych

kolekcji (bibliotek) zwizkw poddawa-

nych pniej testom jest doæ prosty. Wy-

korzystujemy standardowe reakcje che-

miczne, dzi«ki ktrym ze zbioru ele-

mentw wyjæciowych powstaj rozmaite

wi«ksze struktury. Jako uproszczony

przyk¸ad rozwaýmy cztery czsteczki: A1,

A2, B1 i B2. Przyjmujemy, ýe A1 i A2 ma-

j podobn budow«, czyli naleý do tej

samej klasy. Natomiast B1 i B2 przypisu-

jemy do innej klasy zwizkw chemicz-

CHEMIA KOMBINATORYCZNA, mieszanie i ¸czenie moleku-

larnych cegie¸ek, pozwala na szybkie wytwarzanie wielkiej liczby

rozmaitych struktur. Wyspecjalizowany robot (powyýej) dawkuje

odczynniki, z ktrych powstanie obszerny zbir zwizkw che-

micznych (na stronie obok) .

å WIAT N AUKI Czerwiec 1997 27

A by pokona chorob«, uk¸ad od-

dw i 12 kolumn. Tutaj zachodz reakcje

chemiczne. Tablicowe uporzdkowanie

odczynnikw jest u¸atwieniem w przy-

gotowaniu mieszanin reakcyjnych oraz

identyfikacji pobieranych produktw.

Aby otrzyma na przyk¸ad seri« ami-

dw przez ¸czenie oæmiu rýnych amin

z dwunastoma kwasami karboksylowy-

mi, naleýy wkropli pierwsz amin« do

studzienek w pierwszym rz«dzie, dru-

g do drugiego rz«du itd., a nast«pnie

doda kwasy karboksylowe, kaýdy z

nich do jednej z dwunastu kolumn. Z

20 elementw moýna zatem w ten spo-

sb otrzyma bibliotek« 96 rýnych

zwizkw chemicznych.

Syntez« kombinatoryczn chemicy

zaczynaj cz«sto od przy¸czenia pierw-

szego zestawu elementw do chemicz-

nie oboj«tnych, mikroskopijnych pere¸ek

polistyrenowych (cz«sto nazywanych

pod¸oýem sta¸ym). Nie przereagowany

materia¸ jest odmywany po kaýdej re-

akcji; pozostaj jedynie zakotwiczone

produkty. Korzyæci p¸ynce z ¸atwego

oczyszczania przewaýaj nad kompli-

kacjami zwizanymi z koniecznoæci

osadzania zwizkw na pod¸oýu i p-

niejszego ich uwalniania.

Rutynowe operacje w syntezie rw-

noleg¸ej, takie jak wkraplanie odczyn-

nikw do odpowiednich studzienek,

w wielu laboratoriach powierza si« dziæ

wyspecjalizowanym robotom. Dzi«ki

temu proces staje si« dok¸adniejszy

i mniej pracoch¸onny. Pierwsze zauto-

matyzowane urzdzenie do syntezy

40 zwizkw jednoczeænie skonstruo-

wali naukowcy z laboratoriw Parke-

-Davis. W firmie Ontogen powsta¸ na-

tomiast robot, ktry moýe wytwarza

nawet 1000 substancji dziennie. Czas

potrzebny do zakoÄczenia syntezy rw-

noleg¸ej zaleýy od liczby produkowa-

nych zwizkw; jej podwojenie wyd¸u-

ýa go niemal dwukrotnie. Te praktyczne

wzgl«dy ograniczaj wielkoæ tworzo-

nych bibliotek najwyýej do kilkudzie-

si«ciu tysi«cy zwizkw chemicznych.

Synteza rwnoleg¸a

KROK 1

Zacznij od p¸ytki mikromiareczkowej,

czyli plastikowego arkusza z wg¸«bienia-

mi. Wg¸«bienia wype¸nij cz«æciowo

zawiesin oboj«tnych chemicznie

pere¸ek polistyrenowych (szare k¸ka) .

Typowa p¸ytka zawiera 8 rz«dw

i 12 kolumn, czyli 96 mikrostudzienek;

na rysunku przedstawiono

tylko jej lewy grny rg.

PEREüKA POLISTYRENOWA

KROK 2

Do zawiesiny polistyrenowych pere¸ek

dodaj pierwszy zestaw czsteczek

(kwadraty) naleýcych do klasy A,

tak aby A1 znalaz¸y si« w pierwszym

rz«dzie, A2 w drugim itd. Nast«pnie

przefiltruj zawartoæ wszystkich

studzienek w celu oddzielenia nie

przereagowanych odczynnikw

(tych, ktre nie zwiza¸y si«

z polistyrenowymi pere¸kami).

Dziel i mieszaj

CZSTECZKA A1

Inny sposb tworzenia kombinato-

rycznych bibliotek, znany pod angiel-

sk nazw split-and-mix (dziel i mie-

szaj), zaproponowa¸ w koÄcu lat

osiemdziesitych çrpd Furka, obecnie

pracujcy w firmie Advanced Chem-

Tech w Louisville (Kentucky). Inaczej

niý w syntezie rwnoleg¸ej, podczas kt-

rej kaýdy zwizek pozostaje w odr«b-

nym naczyniu, w technice split-and-mix

otrzymujemy mieszanin« wielu produk-

tw. Dzi«ki temu potrzeba mniej naczyÄ

reakcyjnych, a liczba produktw roænie

nawet do kilku milionw. Cen s trud-

noæci z identyfikacj i testowaniem bio-

logicznej aktywnoæci poszczeglnych

zwizkw w z¸oýonych mieszaninach.

Zasad« procesu split-and-mix wyja-

ænimy na prostym przyk¸adzie. Niech

A, B i C oznaczaj trzy zestawy substan-

cji; kaýdy z nich zawiera trzy elementy

(A1, A2, A3; B1, B2, B3 itd.). Zaczynamy

od trzech probwek z polistyrenowymi

pere¸kami. W pierwszej do pere¸ek przy-

czepiamy czsteczki A1, w drugiej Ð A2,

w trzeciej natomiast Ð A3. Pniej trzy

rodzaje czsteczek A (wszystkie zwi-

zane z polistyrenowym noænikiem)

umieszczamy we wsplnym naczyniu,

dok¸adnie mieszamy i znw dzielimy

na trzy porcje. Teraz w kaýdej z trzech

probwek znajduje si« mieszanina cz-

stek A. Nast«pnie do pierwszej dodaje-

my czsteczki B1, do drugiej Ð B2, do

trzeciej zaæ Ð B3. W kolejnym analogicz-

nym cyklu wprowadzamy czsteczki

KROK 3

Dodaj drugi zestaw czsteczek klasy B

(trjkty) . B1 wkraplaj do pierwszej

kolumny, B2 do drugiej itd. Przeprowad

filtrowanie tak jak w poprzednim kroku.

CZSTECZKA B1

KROK 4

Po skompletowaniu 96-elementowej

biblioteki od¸cz koÄcowe produkty

od polistyrenowego pod¸oýa,

aby podda je prbom

aktywnoæci biologicznej.

28 å WIAT N AUKI Czerwiec 1997

z zestawu C. Otrzymujemy w ten spo-

sb 27 rýnych zwizkw.

Aby wy¸owi najcenniejsze z nich, na-

leýy bada æredni aktywnoæ kolejnych

mieszanin. Pniej stosujc rýne tech-

niki, dedukuje si«, ktry z ãkombinato-

rycznychÓ produktw obecnych w naj-

bardziej aktywnej mieszaninie ma

poýdane w¸aæciwoæci biologiczne.

Kilka firm farmaceutycznych zauto-

matyzowa¸o takýe procedur« split-and-

-mix. Jedno z pierwszych tego typu

urzdzeÄ (opracowane w laboratoriach

firmy Chiron) potrafi syntetyzowa mi-

lion zwizkw w cigu kilku tygodni.

Specjalny robot zajmuje si« dozowaniem

odczynnikw, mieszaniem i porcjowa-

niem sta¸ego pod¸oýa.

Wspomnieliæmy juý, ýe podczas syn-

tez opartych na dzieleniu i mieszaniu

trudno zidentyfikowa konkretn ak-

tywn substancj«, ktra kryje si« w z¸o-

ýonej miksturze. Kit Lam z University

of Arizona znalaz¸ sposb przezwyci«-

ýenia tej trudnoæci, zauwaýywszy, ýe

pod koniec syntezy wszystkie czstecz-

ki przyczepione do danej pere¸ki noæni-

ka maj t« sam struktur«. Chemicy mo-

g wi«c odizolowa polistyrenowe ku-

leczki zwizane z poýdan substancj

aktywn, pniej zaæ pos¸uýy si« czu-

¸ymi metodami analitycznymi, aby usta-

li jej budow«. Niestety, metoda ta mo-

ýe by stosowana tylko w wypadku

niektrych zwizkw, takich jak pepty-

dy lub krtkie fragmenty DNA.

Inni badacze opracowali metody

oznaczania pere¸ek chemicznymi ãety-

kietamiÓ Ð swego rodzaju odpowiedni-

kiem kodu kreskowego Ð z ktrych

moýna odczyta histori« dodawania ko-

lejnych elementw. Odczytanie etykie-

ty jest jednoznaczne z identyfikacj za-

kotwiczonych substancji. Szczeglnie

duýo wnieæli tu naukowcy z biotechno-

logicznej sp¸ki Pharmacopeia, ktrzy

wykorzystali procedury W. Clarka Stil-

la z Columbia University. K¸opoty

z identyfikacj zwizkw s jednak po-

waýne, dlatego wi«kszoæ firm poprze-

staje dziæ raczej na syntezie rwnoleg¸ej.

Benzodiazepiny naleý do najcz«æciej

przepisywanych lekw. Najlepiej zna-

nym przyk¸adem jest diazepam (rela-

nium, valium), lek uspokajajco-nasen-

ny. Aktywnoæ biologiczn przejawia

jednak rwnieý wiele innych pokrew-

nych zwizkw, ktre mog dzia¸a

przeciwdrgawkowo, pobudzajco, prze-

ciwzakrzepowo (antagonistycznie do

czynnika pobudzajcego p¸ytki krwi).

Naleý teý do nich inhibitory enzymu

odwrotnej transkryptazy wirusa HIV

oraz inhibitory farnezylotransferazy

bia¸ka Ras (enzymu uczestniczcego

w procesach nowotworowych).

Wieloæ zastosowaÄ sprawi¸a, ýe ben-

zodiazepiny by¸y pierwsz grup

zwizkw, w ktrej poszukiwano no-

wych lekw metodami chemii kombi-

natorycznej. Jeden z nas (Ellman) przed-

stawi¸ w 1992 roku wraz z Barrym

Buninem (takýe z University of Califor-

nia w Berkeley) sposb syntezy benzo-

diazepin na sta¸ym pod¸oýu. Otwarto

w ten sposb drog« do tworzenia biblio-

tek zawierajcych tysice potencjalnie

uýytecznych pochodnych.

Niedawno usprawniliæmy t« proce-

dur«, istotnie zwi«kszajc liczb« pro-

duktw. Najtrudniejszym zadaniem

Synteza typu split-and-mix

CZSTECZKA A1

KROK 1

Zacznij od probwek wype¸nionych

zawiesin oboj«tnych chemicznie kulek

polistyrenowych (szare k¸ka) . Rysunek,

dla uproszczenia, przedstawia tylko trzy

probwki, w rzeczywistoæci moýe ich by

dziesitki. Dodaj pierwszy zestaw

czsteczek klasy A (kwadraty) ,

tak aby w pierwszej znalaz¸ si«

zwizek A1, w drugiej A2 itd.

PEREüKA

POLISTYRENOWA

KROK 2

Wymieszaj zawartoæ wszystkich

probwek.

KROK 3

Mieszanin« podziel na trzy rwne cz«æci.

Dodaj drugi zestaw czsteczek klasy

B (trjkty) , wkraplajc B1 do pierwszej

probwki, B2 do drugiej itd. Kroki 2 i 3

moýesz powtarza wielokrotnie Ð

zaleýnie od zaplanowanej liczby

elementw w koÄcowym produkcie.

CZSTECZKA B1

Biblioteki lekw

KROK 4

Odfiltruj nie przereagowane odczynniki,

oddziel gotowe zwizki od pere¸ek

polistyrenowych. Cz«sto bada si«

zawartoæ kaýdej z probwek w celu

okreælenia æredniej aktywnoæci

biologicznej mieszanin. Najlepsze

w¸aæciwoæci moýe mie na przyk¸ad

mieszanina, do ktrej ostatnio wkraplano

B2. Wwczas powtarza si« syntez«,

kojarzc B2 z rýnymi substancjami A,

aby ustali, ktry spoærd zwizkw

typu AÐB2 jest najbardziej skuteczny.

Obie metody syntezy kombinatorycz-

nej debiutowa¸y jako sposb tworzenia

peptydw. Czsteczki te, cho bardzo

istotne dla organizmu, nie s zbyt przy-

datne jako leki, poniewaý rozk¸adaj si«

w jelitach, trudno si« wch¸aniaj w ýo-

¸dku i szybko znikaj z krwiobiegu. In-

tensywne zainteresowanie chemi kom-

binatoryczn pojawi¸o si« wwczas, gdy

zrozumiano jej przydatnoæ do syntezy

uznanych farmaceutykw, takich jak

zwizki z grupy benzodiazepin.

å WIAT N AUKI Czerwiec 1997 29

ROBOT w Arris Pharmaceutical automatycznie przesuwa p¸ytki mikromiareczkowe z bi-

bliotekami kombinatorycznymi do urzdzenia, ktre testuje ich aktywnoæ biologiczn.

wyspecjalizowanymi w tej dziedzinie

przedsi«biorstwami.

Metody kombinatoryczne uchodz

dziæ cz«sto za rutynowe, a zastosowanie

ich nie ogranicza si«, rzecz jasna, tylko

do benzodiazepin. Chemicy wykorzy-

stuj kombinatoryczne biblioteki ma¸ych

czsteczek organicznych jako rd¸o

obiecujcych substancji wyjæciowych

bd do optymalizacji aktywnoæci zna-

nego juý specyfiku. Podczas poszukiwaÄ

nowej substancji wyjæciowej powstaj

cz«sto bardzo obszerne biblioteki, z dzie-

sitkami tysi«cy lub nawet milionami

produktw koÄcowych. Natomiast bi-

blioteki s¸uýce zwi«kszeniu skuteczno-

æci lub bezpieczeÄstwa stosowania ist-

niejcego specyfiku s z regu¸y znacznie

mniejsze, kilkusetsk¸adnikowe.

Kilka firm farmaceutycznych przy-

stpi¸o juý do klinicznego testowania le-

kw, ktre odkryto dzi«ki metodom che-

mii kombinatorycznej. Poniewaý odpo-

wiednie programy badawcze zosta¸y

wdroýone stosunkowo niedawno, ýad-

nego zwizku spoærd potencjalnych

kandydatw nie sprawdzano jeszcze

wystarczajco d¸ugo, by uzyska akcep-

tacj« Food and Drug Administration.

Jednak ukazanie si« na rynku pierw-

szych owocw chemii kombinatorycznej

jest juý tylko kwesti czasu.

Za przyk¸ad moýe s¸uýy preparat

opracowany w firmie Pfizer. Tradycyj-

ne metody doprowadzi¸y tam w 1993 ro-

ku do odkrycia substancji wyjæciowej,

podczas projektowania syntez kombi-

natorycznych jest wybranie warunkw

eksperymentalnych, gwarantujcych

minimalizacj« reakcji ubocznych, a tym

samym Ð niski poziom zanieczyszczeÄ.

Optymalizacja wszystkich parametrw

zaj«¸a nam ponad rok, pniej jednak

zdo¸aliæmy (wraz z Buninem) wytwo-

rzy metod rwnoleg¸ej syntezy 11 200

zwizkw w cigu zaledwie dwch

miesi«cy.

zacz¸ realizowa nowe projekty ba-

dawcze. W cigu minionych 5 lat po-

wsta¸y dziesitki niewielkich firm sto-

sujcych wy¸cznie t« metod«, a prawie

wszystkie duýe koncerny maj obecnie

w¸asne oddzia¸y chemii kombinatorycz-

nej lub wsp¸pracuj z mniejszymi,

Obiecujce substancje

Okaza¸o si«, ýe biblioteka ta zawiera-

¸a kilka potencjalnych lekw. W ramach

projektu badawczego realizowanego

wsplnie z Victorem Levinem i Ray-

mondem Budde z University of Texas

M. D. Anderson Cancer Center w Hou-

ston zidentyfikowaliæmy pochodn dia-

zepiny, ktra inhibuje enzym zaanga-

ýowany w powstawanie raka okr«ýni-

cy i w osteoporoz«. Natomiast wsp¸-

praca z Garym Glickiem i jego kolegami

z University of Michigan zaowocowa-

¸a odkryciem innej benzodiazepiny, ha-

mujcej oddzia¸ywanie jednoniciowe-

go DNA z przeciwcia¸ami, ktre moýe

by istotn przyczyn tocznia uk¸ado-

wego rumieniowatego. Zwizki te pod-

dawane s na razie wst«pnym prbom

laboratoryjnym.

Odkd wraz z innymi chemikami

wykazaliæmy przydatnoæ technik kom-

binatorycznych do syntezy potencjal-

nych lekw, przemys¸ farmaceutyczny

POLISTYRENOWE KULECZKI (widoczne tutaj w oko¸o 100-krotnym powi«kszeniu) to

standardowy rekwizyt chemii kombinatorycznej. Produkty reakcji przyczepione do ich

powierzchni ¸atwo jest odseparowa od zb«dnego, nie przereagowanego materia¸u. Fo-

tografia przedstawia wynik testu aktywnoæci biologicznej; kolor czerwony sygnalizuje

obecnoæ syntetycznego receptora steroidw.

30 å WIAT N AUKI Czerwiec 1997

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: