Poznawanie genów
Zasoby genetyczne organizmu można precyzyjnie modyfikować w określonym kierunku.
Enzymy restrykcyjnie rozcinają bardzo długie cząsteczki DNA na specyficzne fragmenty, którymi można łatwo manipulować, a ligazy DNA służą do łączenia tych fragmentów. Dostępność enzymów restrykcyjnych oraz ligaz DNA umożliwia traktowanie sekwencji DNA jako modułów, które w dowolny sposób można przemieszczać z jednej cząsteczki DNA do drugiej. Technologia rekombinacji DNA opiera się na enzymologii kwasów nukleinowych. Drugi fundament tej technologii to język tworzenia par przez zasady.
Hybrydyzjacja komplementarnych sond DNA (cDNA) lub RNA stanowi potężny i czuły sposób wykrywania określonych sekwencji.
Wirusy - skutecznie wprowadzają swój DNA do komórek gospodarza, zmuszając je albo do replikacji genomu wirusowego i produkowania wirusowych białek, albo do wbudowania wirusowego DNA do genomu gospodarza.
Plazmidy - są pomocniczymi chromosom występującymi w bakteriach.
Genom człowieka - 3 miliardy par zasad.
______________________________________________________________________________
5.1 Podstawowe narzędzia wykorzystywane w poznawaniu genów
1. Analiza restrykcyjna. Enzymy restrykcyjne to precyzyjne molekularne skalpele, za pomocą którzycg badacz może manipulować odciankami DNA.
2.Techniki hybrydyzacyjne. Typu Southhern’a i northern’a są używane do rozdziału i charekteryzowania, odpowiednio DNA i RNA. Hybrydyzacja typu western - używane są przeciwciała do charakteryzowania białek.
3. Sekwencjonowanie DNA. Możliwe jest precyzyjne określenie sekwencji nukleotydów w cżasteczce DNA. Ujawniło bogactwo informacji dotyczącej architektury genów, kontroli ekspresji genów i struktury białek.
4. Chemiczna synteza kwasów nukleinowych na stałym podłożu. Można syntezować de novo fragmenty kwasów nuklein. o ściśle określonyej sekwencji, które następnie używa się od identyfikacji lum amplifikowania(powielania) innych kwasów nuklein.
5. Reakcja łańcuchowej polimeryzacji (PCR). Dzięki niej można powielić fragment DNA nawet w miliardach kopii. Jedna cząsteczka DNA można zostać amplifikowana do ilości, które umożliwiają jej scharakteryzowanie i manipulować nią. Technika jest wykorzystywana do wykrywania patogenów i chorób genetycznych, odkrywania żródła pochodzenia włosa pozostawionego na miejscu zbrodnii i ‘wskrzeszenia’ genów ze skamieniałości.
KOMPUTER i tak jest niezbędny xDXD
Enzymy restrykcyjne rozcianją DNA na specyficzne fragmenty
Enzymy restrykcyjne (endonukleazy restrykcyjne) rozpoznają specyficzne sekwencje zasad w 2u niciowej DNA i rozcinają obie nici DNA w ściśle określonych miejscach. Są niezastąpione w badaniach struktury chromosomów, sekwencjonowania b.długich cząst. DNA, izolowaniu genów i tworzeniu nowych cząstek DNA, nadających się do klonowania. En.res. odkryli Arber i Smith, a Nathans zapoczątkował ich stosowanie.
En.res. występują u wielu prokariotów. Ich biologiczna rola polega na rozcinaniu obcych cząsteczek DNA. Nie degradują komórkowego DNA gospodarza, poniewż miejsca rozpoznawane przez własne En.res. są zmetylowane. Wiele En.res. rozpoznaje specyficzne sekwencje 4rech do 8miu par zasad i hydrolizuje wiązanie fosfodiestrowe w obu niciach DNA rozpoznawanego regionu. Charakt. cechą rozpoznawyanych miejsc jest ich podwójna symetria obrotowa - palindromowa (od przodu i tyłu tak samo sie czyta, np. radar), czyli odwrotnie powtórzona, a miejsca rozcinania łańcuchów DNA są usytuowane symtetrycznie.
Oczyszczono ponad 100 róznych En.res. Ich nazwy składają się z 3 literowego skrótu nazwy organizmu z jakiego pochodzą, np. Eco od Escherichia, za którym nastepuje oznaczenie szczepu (o ile jest to konieczne) i numer enzymu podany cyframi rzymskimi (jeśli dany szczep produkuje więcje niż 1den En.res.)
En.res. wykorzystuje się do rozcinania długich odcinków DNA na specyficzne fragmenty, jest na nich łatwiej pracować. Uzyskany w wyniku działania jednego En.res.może zostać specyficznie pocięty przez kolejny. Obraz takich fragmentów może stanowić odcisk palca. Stosując wiele En.res. można sporządzić mapy dużych chromosomów, zbudowanych z setek milionów par zasad.
Fragmenty restrykcyjne można rodzielić elektroforetycznie w żelu i uwidaczniać
Nawet małe różnice między spokrewnionymi DNA można wykryć dzięki rozdzieleniu w żelu i uwidocznieniu ich fragmentów restrykcyjnych, jest to elektroforeza żelowa. Ruchliwość elektroforetyczna DNA w różnych żelach jest w pewnych granicach odwrotnie proporcjonalna do logarytmu długości tego fragmentu, wyrażanej liczbą par zasad.
Żele poliakryloamidowe do rozdzielnia fragmentów o długości do 1000 par zasad. Żele agarozowe - długie, nawet do 20 kpz.
Ważną cechą żeli jest ich zdolność rozdzielcza. W odpowiednich żelach mozna rozdzielić fragmenty nawet różniące się tylko jednym nuklotydem, a stosując elektorforezę w pulsującym polu magnetycznym (PFGE) można rozdzielić całe chromosomy, zawierające miliony nukleotydów - rozciąganie i relaksacja DNA, przez włączanie i wyłączanie pola elektrycznego. Prążki lub plamy promieniotwórczego DNA można ukazywać przy pomocy autoradiografii. DNA może być też barwione bromkiem etydyny, który po związaniu się z 2u niciowym DNA i wzbudzeniem przez światło intensywnie fluoryzuje, daje pomarańczowe światło.
Fragment restrykcyjny, zawierający specyficzną sekwencję zasad, można wyryć przez hybrydyzowanie go z komplementarnym 1no niciowym DNA wyznakowanym promieniotwórczo. Metoda/Hybrydyzacja Southern (hybrydyzacja DNA-DNA). Mieszaninę fragmentów restrykcyjnych rozdziela się elektroforetycznie w żelu agarozowym, denaturuje do formy 1no niciowej i przenosi na filtr nitrocelulozy. DNa związany z nitrocelulozą zostanie poddany hybrydyzacji z sondą, którą jest 1no niciowy DNA wyznakowany 32P. Sonda hybrydyzuje, audioradiografia ujawnia położenie dupleksów (nić należąca do fragmentu restrykcyjnego i sondy DNA).
Metoda/Hybrydyzacja Northern (hyb.DNA-RNA). To samo co z DNA, ale tutaj jest RNA.
Metoda Wester (immunodetekcja białek na filtrach). Technika wykrywania określonych białek z wykorzystaniem swoistych przeciwciał.
Najczęściej sekwencjonuje się DNA przez kontrolowaną terminację replikacji
Kluczem do poznania kolejności zasad w DNA jest uzyskanie fragmentów, których długość zależy od ostatniej zasady w sekwencji. Można to uzyskać stosując kontrolowane przerywanie replikacji enzymatycznej (metoda dideoksy Sangera). Jest to prosta metoda. Ta sama procedura jest stosowana w 4rech mieszaninach reakcyjnych. We wszystkich wykorzystuje się polimerazę DNA, by utworzyć nić komplementarną do określonej sekwencji w 1no niciowej DNA. Syntezę inicjuje fragment DNA, syntezowany chemicznie, który jest komplementarny do części sekwencji poznanej w wyniku badań. Oprócz 4rech rodzajów trifosforanów deoksyrybonukleozydów (znakowanych promieniotwórczo), każda mieszanina zawiera małą ilość 2’,3’-dideoksyanalogu jednoego z 4rech nukleotydów (każdy jest inny).
Analog jest wbudowywany, bo uniemozliwia wydlużanie rosnącego łańcucha, bo nie ma grupy 3’-hydroksylowej, która jest niezbędna do wiązania fosfodiestrowego. Czasami polimeraza włącza własciwy nukleotyd, a czasmi jego analog, co prowadzi do zastopowania rekacji. I tu jest kupa, bo oni opisują włączanie do dATP, i wtedy tylko dideoksyanalog będzie włączany tam gdzie są tyminy, ale nie wiem czy to się odnosi do każdego czy tylko do dATP.
Cztery zbiory fragmentów o zakończonym łańcuchu poddaje się elektroforezie i odczytuje sekwencję zasad DNA z 4rech ścieżek na audioradiogramie.
Alternatywa, wydajniejsza niż audioradiografii to detekcja - znakowanie DNA znacznikami fluorescencyjnymmi. Każdy z 4rech typów dideoksyanalogów ma przyłączony marker fluorescencyjny -inna barwa dla każdego nukleotydu. Uzywanie takiej mieszaniny - umożliwia sekwencjonowanie w jednej reakcji, której produkty idą na elektroforezę. Określone fragmenty są wykrywane w żelu, na podstawie fluorescencji. Można tak określić na raz 500 zasad.
Metody syntezy na stałym podłożu pozwalają automatycznie syntetyzować sondy DNA i geny
1no niciowy DNA można syntezować przez kolejne dodanie aktywowanych monomerów do rosnącego łańcucha, związanego z nierozpuszczalnym podłożem. Aktywowane monomery to: protonowane 3’-fosfoamidyniany deoksyrybonukleozydu.
1szy etap: atom 3’-fosforu wchodzącej jednostki monomerycznej zostaje przyłączony do tlenu 5’ rosnącego łańcucha -> tworzy triester fosforynowy. Grupa 5’-hydroksylowa aktywowanego monomeru nie ulega reakcji, bo jest zablokowana dimetoksytritylową grupą ochronną (DMT), podobnie też 3’-fosforanowa, blokowana jest ϐ-cyjanoetylem (ϐCE). W podobny sposób są blokowane grupy aminowe puryn i pirymidyn.
2gi etap: Reakcja sprzęgania: W warunkach bezwodnych (woda reaguje z fosfoamidynianami). Triester fosforynowy (P jest 3rój wartościowe) jest utleniany za pomocą jodu -> daje triester fosfornowy, w którym P jest 5cio wartościowe.
3ci etap: Usunięcie ochronnej grupy DMT z końca 5’ rosnącego łańcucha za pomocą kwasu dichlorooctowego, który nie usuwa innych grup blokujących.
Wydłużony łańcuch DNa o 1ną jednostkę monomeryczną łańcucha DNA jest gotowy do następnej rundy xD Każdy cykl przyłączenia 1go monomeru trwa 10 minut, a elongacji ulega ponad 99% łańcuchów.
Chemiczna synteza, wykorzystująca stałe podłoża jest świetna do syntezy DNA i polipeptydów, ponieważ wymagany produkt pozostaje związany z nierozpuszczalnym podłożem aż do końcowego uwolnienia. Wszystkie reakcje zachodzą w jednym naczyniu, a przebieg reakcji w kierunku syntezy można wymusić nadmiarem dodawanych rozpuszczalnych odczynników. Nadmiar odczynników i uboczne produkty są usuwane przez przemycie podłoża czyli szklanych kuleczek xDXD.
W końcowym etapie: usunięcie wszystkich blokujących grup poprzez NH3, a oligonukleotyd zostaje odłączony od podłoża. Elongacja przebiega z różną wydajnością - więc DNA są różnej długości - najdłuższy projektowy.
Oczyszczanie: poprzez wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej lub elektroforezę w żelu poliakryloamidowym. Metoda zautomatyzowana - nawet DNA o dł. 100 nukleotydów.
Oligonuklotyd znakowany 32P lub znacznikiem fluorescencyjnym na jednym końcu można wykorzystać do wyszukania komplementarnej sekwencji w bardzo długim DNA, a nawet w całym genomie. Użycie oligonukleotydów jako sond DNA ma wielkie zastosowanie. Np. Sonda która tworzy sparowany odcinek ze znaną komplementarną sekwencją na chromosomie, może stanowić punkt wyjścia do poznania nieznanych sąsiednich. Taką sondę można wykorzystać jako starter do zainicjowania replikacji DNA przez polimerazę DNA.
Wybrane sekwencje DNA można wielkrotnie powielać stosując reakcję łańcuchową polimeryzaji PCR.
Mullis wynalzł to, w sensie PCR - metoda powielania określonych sekwencji DNA - rekacja łańcuchowa polimeryzacji. Chcemy jakąś tam sekwencję 2u niciowego DNA, która jest otoczona przez takie, które nas nie interesią. Możemy se uzyskać tą, którą chcemy w milionach, wtedy gdy znamy te, które nas nie interesią, a przylegają do tej pożądanej. Żeby przeprowadzić PCR musi dać do r-ru zawierającego docelową sekwencję DNA: 1)parę starterów - hybrydyzują z sekwencjami przylegającymi do tej NASZEJ 2)trifosforany wszystkich 4rech deoksyrybonukleozydów (dNTP) 3) termostabilną polimerazę DNA.
Cykl PCR składa się z 3 etapów.
1.Oddzielenie nici DNA - denaturacja. Dwie nicie wyjściowej DNA oddzielają się przez ogrzewanie r-ru w temp=95 stopni C, przez 15 sekund.
2.Hybrydyzacja starterów. Gwałtowne ochłodzenie do 54C. Jeden starter hybryd. z sekwencją przylegającą do końca 3’ sek.docelowej, a drugi też do 3’, ale nie do nici komplementarnej.
3. Synteza DNA (elongacja). Roztwór ogrzewa się do 72C - temp. optymalna dla polimerazy DNA Taq. Ta termostabilna polimeraza pochodzi od termofila - Thermus aquaticus, który żyje w żródłach termalnych. Polimeraza wydłuża sekwencję od starterów w kierunku sek.docelowej. Synteza DNA zachodzi na obu niciach i rozciąga się poza sek.docelową.
Można se to robić tak cyklicznie :) Po pierwszym -> dupleksy się podgrzewa i powstają 4 cząsteczki dwuniciowe. I znowu leci kolejny cykl. Na końcu 3go cyklu pojawiają się 2 krótkie nici, które składają się tylko z sek.docelowej i odcinków starterowych. Następne cykle -> powielanie sek.docelowej wykładniczo, podczas gdy dłuższe cząsteczki DNA są powielane liniowo i służą jako matryce do syntezy większej liczby krótkich fragmentów. Teoretycznie po n cyklach sek. jest powielna 2 do n razy, po 20 cyklach - milion, po 30 miliard. i to w czasie krótszym niż 1h.
Cechy tej metody:
1) sek.powielanego fragmentu DNA nie musi być znana, musimy znać przylegające
2) powielana sek. może być znacznie dłuższa niż startery
3) amplifikacja może zajść też wtedy kiedy startery nie są idealnie komplementarne do sek.otaczających
4) PCR jest wysoce specyficzną metodą, ponieważ hybrydyzacja starterów zachodzi w stostunkowo wysokiej temp. na dopasowanie startera ma wpływ temperatura i stężenie soli
5) jest to metoda niezwykle czuła, wykrywa nawet pojedyńczą cząsteczkę DNA
PCR jest potężnym narzędziem w diagnostyce medycznej, sądownictwie i w badaniu ewolucji molekularnej
W medycynie - stosując specyficzne startery można wykryć wirusy i bakterie, np. HIV 1, jeszcze jak normalnie wirus nie jest do wykrycia, bo nie doszło do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej, można wykryć też prątki gruźlicy, normalnie jest to strasznie trudne.Obiecująca metoda wykrywania nowotworów, mozna wykryć mutacje w genach Ras, można monitorować chemioterapię. Można stwierdzić wyeliminowanie komórek rakowych i zaprzestać podawania leków, bo ich już nie ma i również wznowić podawanie lekó, bo się pojawią. PCR też dobra do wykrywania białaczki spowodowanej rearanżacją chromosomów.
Kryminalistyka i sądownictwo - profil DNA poszczególnych osób jest wysoce swoisty - jest dużo zmiennych loci genetycznych. Np. zmienność locus zgodności tkankowej - HLA - decyduje o odrzuceniu przeszczepów. Amplifikacja ważna przy ustalaniu ojcostwa, krew i nasienie też rozpoznaje -> gwałty i inne brzydkie sprawy! IlośćDNA we włosie jest wystarczająca żeby zidentyfikować człeka.
DNA - niezwykle stabilna, zwłaszcza jak zabezpieczona przed powietrzem, światłem i wodą. Takie fragmenty mogą przetrwać tysiące lat. PCR jest idealną metodą powielania muzealnego DNA.
5.2 Technologia rekombinacji DNA zrewolucjonizowała wszystkie dziedziny biologii
Geny wprowadzone do komórek mogą ulegać transkrypcji i translacji.
Enzymy restrykcyjne i ligaza DNA są podstawowymi narzędziami w tworzeniu zrekombinowanych cząsteczek DNA
Jak się tworzy DNA w laboratorium? Fragment DNA, który nas interesuje łączymy z wektorem (też DNA). Każdy wektor może się autonomicznie replikować w odpowiednim gospodarzu.
U E.Coli jako wektory stosuje się plazmidy (koliste cząst. DNA pełniące funkcję chromosomów pomocniczych) lub wirusy (np. fag lambda). Wektor do połączenia nas z interesującym fragmentem DNA trzeba najpierw przygotować do akcji, czyli wziąć go rozciąć enzymem restrykcyjnym w specyficznym miejscu. Tu na przykład plazmid pSC101 jest rozcianany przez enzym EcoRI w jednym miejscu. Enzym ten rozcina DNA tak, że tworzą się jednoniciowe komplementarne końce, końce kohezyjne (tzw. Lepkie końce). Do tak rozciętego plazmidu można wprowadzić dowolny fragment DNA, jeśli ma takie same kohezyjne końce. Wprowadzany odcinek DNA można uzyskać przez rozcięcie większego fragmentu DNA używając tego samego enzymu restrykcyjnego co dla plazmidu.
Potem plazmid i wprowadzony fragment DNA łączony jest za pomocą ligazy DNA, która katalizuje powstanie wiązań fosfodiestrowych. Ligaza DNA potrzebuje wolnej grupy 3’-hydroksylowej oraz ufosforylowanej grupy 5’-OH. Wymaga też tego, żeby łączone odcinki DNA znajdowały się w obrębie dwuniciowej helisy. Energia potrzebna do ligacji pochodzi z ATP lub NAD+.
Metoda łączenia DNA przez kohezyjne końce ma zastosowanie dzięki chemicznie syntetyzowanym krótkim łącznikom DNA, tzw. linkerom, które mogą być rozcinane przez enzymy restrykcyjne. Najpierw łącznik, czyli ten linker jest przyłączany kowalencyjnie do końców fragmentu DNA lub wektora. Do dowolnej cząsteczki DNA można dołączyć kohezyjne końce, odpowiadające określonym enzymom restrykcyjnym. (przykład na rys. 5.11 strona 143)
Plazmidy i fag lambda są dogodnymi wektorami do klonowania DNA w bakteriach.
Plazmidy to dwuniciowe koliste cząsteczki DNA występujace naturalnie w niektórych bakteriach. Zawierają geny inaktywacji antybiotyków, wytwarzania toksyn i rozkładu naturalnych produktów. Te pomocnicze chromosomy mogą się replikować niezależnie od genomu gospodarza, ale w pewnych warunkach są zbędne. Komórka bakteryjna może w ogóle nie zawierać plazmidów, ale może też mieścić nawet 20 kopii jakiegoś plazmidu.
Plazmid pBR322
Najbardziej użyteczny do klonowania, zawiera geny oporności na tetracyklinę i ampicylinę (podobny do penicyliny). Plazmid można rozciąć w jednym miejscu przez endonukleazy i można tam wbudować fragment DNA. Insercja w miejsce rozpoznawane przez enzym EcoRI nie wpływa na geny oporności na antybiotyki, ale insercja w miejsca HindIII, SalI i BamHI inaktywuje gen oporności na tetracyklinę - taki efekt nazywamy INAKTYWACJĄ INSERCYJNĄ. Komórki zawierające pBR322 z insertem (wstawką DNA) są oporne na ampicylinę, ale wrażliwe na tetracyklinę i na tej podstawie można przeprowadzać ich selekcję. Komórki, które nie przyjęły wektora są wrażliwe na oba antybiotyki, natomiast te, które przyjęły wektor bez insertu są oporne na obydwa antybiotyki.
Plazmid pUC18
Zawiera miejsce inicjacji replikacji i marker selekcyjny nadający oporność na ampicylinę. Zawiera dodatkowo gen kodujący β-galaktozydazę. W obecności specyficznego analogu substratu enzym ten produkuje niebieski barwnik. Gen kodujący ten enzym ma rejon polilinkera, czyli sekwencję z wieloma unikatowymi miejscami restrykcyjnymi. Polilinker może być rozcinany jednym z wielu enzymów restrykcyjnych albo zestawem dwóch enzymów, co pozwala na wszechstronny dobór fragmentów DNA, które mogą być wklonowane do plazmidu. Insercja fragmentu DNA do polilinkera unieczynnia gen β-galaktozydazy. Komórki ze zrekombinowanym DNA można łatwo zidentyfikować, bo nie będą produkować niebieskiego barwnika.
Fag labmda
Może zniszczyć swojego gospodarza albo stać się jego częścią.
W trybie litycznym wszystkie funkcje wirusowe ulegają ekspresji: wirusowy DNA i białka są szybko produkowane i pakowane w cząstki wirusowe, co prowadzi do lizy komórki gospodarza i uwolnienia 100 potomnych cząstek wirusowych - wirionów.
W trybie lizogenicznym fagowy DNA ulega integracji z genomem komórki gospodarza i może razem z nim replikować przez wiele pokoleń, pozostając nieaktywnym. Zmiany w środowisku mogą wywołać ekspresję uśpionego wirusowego DNA i może on przejść w tryb lityczny.
Stworzono zmutowane fagi λ przeznaczone specjalnie do klonowania. Jednym z bardziej przydatnych jest fag λgt- λβ, zawiera dwa miejsca EcoRI zamiast standardowych pięciu. Po trawieniu EcoRI środkowy segment tak zmutowanego faga λ można usunąć. Dwa pozostałe fragmenty DNA (ramiona) stanowią 72% długości normalnego genomu. Taka ilość DNA to za mało do upakowania go w fag λ, bo upakowaniu ulegają cząsteczki DNA o długości 75-105% długości normalnego genomu. Troche tego nie rozumiem.. xD 105 %? XD Insert (wstawka) DNA o odpowiedniej długości wprowadzony między dwa ramiona fagowego DNA pozwala zrekombinowaną cząsteczkę DNA (93% normalnego długości) upakować w cząstkę fagową. Prawie wszystkie cząstki infekcyjne utworzone w ten sposób zawierają insert w postaci odcinka obcego DNA.
Zmodyfikowane wirusy jako wektory wnikają do bakterii znacznie łatwiej niż wektory plazmidowe. Zrobiono różne mutanty faga lambda, jeden z nich - kosmid może służyć jako wektor dla długich insertów DNA.
Sztuczne chromosomy bakteryjne i drożdżowe
Bardzo długie fragmenty DNA można namnażać w sztucznych chromosomach bakteryjnych (BAC) lub sztucznych chromosomach drożdżowych (YAC).
Wektory BAC są wysoce zmodyfikowaną wersją plazmidów koniugacyjnych F, które są zdolne do włączania insertów o długości nawet 300 kpz.
Wektory YAC mają centromer, sekwencję autonomicznej replikacji (ARS, gdzie rozpoczyna się replikacja), parę telomerów (typowych zakończeń chromosomów eukariotycznych), geny markerowe umożliwiające selekcję oraz miejsce klonowania. W wektorach YAC można klonować inserty nawet o długości 1000 kpz.
Poszczególne geny można klonować po enzymatycznym trawieniu genomowego DNA
Rozkmińmy, jak można klonować gen, występujący w genomie człowieka tylko w jednej kopii. Przygotowuje się dużą kolekcję (lub bibliotekę) fragmentów DNA, a następnie identyfikuje te, które zawierają poszukiwany gen.
Preparat zawierający wiele cząst. genomowego DNA poddaje się mechanicznej fragmentacji lub częściowemu trawieniu enzymami restrykcyjnymi i otrzymujemy duże fragmenty DNA. Rozdziela się to elektroforetycznie i izoluje fragmenty o długosci około 15 kpz. Do końca tych fragmentów przyłącza się linkery, tworzy lepkie(kohezyjne) końce i wprowadza do wektora, takiego jak fag λ, w którym przygotowano identyczne lepkie końce. Zrekombinowanymi fagami infekuj się komórkie E. Coli. Uzyskany w wyniku tego lizat zawiera fragmenty DNA człowieka, znajdujące się w na tyle dużej populacji zrekombinowanych fagów, żeby fragmenty te w sumie stanowiły prawie kompletny genom. Taką kolekcję fagów nazywamy biblioteką genomową.
Bibliotekę genomową przeszukuje się, by odnaleźć interesujący nas gen. Obliczenia pokazały, ze znalezienie poszukiwanej sekwencji w genomie człowieka z 99% prawdopodobieństwem wymaga przeszukania 500 000 klonów. Do szybkich metod przeszukiwania bibliotek nalezy hybrydyzacja DNA.
Rozcieńczona zawiesina zrekombinowanych fagów zostaje najpierw rozprowadzona na murawie bakteryjnej, tam gdzie fagi zainfekowały bakterie powstają łysinki - tam znajdują się klony identycznych fagów. Po nałożeniu filtra nitrocelulozowego na płytkę tworzy się replikę łysinek. Bakterie przyklejone do nitrocelulozy pod...
DWito