INTEGRONY(2).pdf

Tom 51, 2002

Numer 3 (256)

Strony 353–364

1 Instytut Biotechnologii i Antybiotyków

Staroœciñska 5, 02-516 Warszawa

wolinowskar@iba.waw.pl

2 Zak³ad Mikrobiologii Farmaceutycznej

Akademia Medyczna

Oczki 3, 02-007 Warszawa

iA NDRZEJ P £UCIENNICZAK 1

INTEGRONY

Integrony s¹ elementami genetycznymi,

które zaobserwowano stosunkowo niedawno

w genomach kilku ró¿nych rodzajów bakterii

Gram-ujemnych, s¹ one zwi¹zane z obecnoœci¹

genów opornoœci na antybiotyki i œrodki de-

zynfekcyjne. Od lat poœwiêca siê wiele uwagi

zjawisku narastania lekoopornoœci u bakterii,

ukazuje siê wiele prac opisuj¹cych geny wa-

runkuj¹ce to zjawisko. Zaobserwowano, ¿e

geny nadaj¹ce komórkom opornoœæ na ró¿ne

antybiotyki, zlokalizowane w plazmidach, w

obszarze transpozonów lub po prostu w chro-

mosomalnym DNA bakterii, posiadaj¹ w swo-

im otoczeniu silnie homologiczn¹ sekwencjê.

Analiza otoczenia genów opornoœci doprowa-

dzi³a do odkrycia struktur, które w 1989 r. na-

zwano integronami.

Integrony opisuje siê jako elementy gene-

tyczne zdolne do w³¹czania kaset genowych

przez umiejscowion¹ rekombinacjê (ang. site-

specific recombination). W³¹czeanie to umo-

¿liwia enzym integraza, kodowany w obrêbie

integronu. Bardzo szczególn¹ struktur¹ jest ka-

seta genowa. Jest to mobilny element integro-

nu, mo¿e ona istnieæ jako forma liniowa,

w³¹czona do struktury integronu, lub jako koli-

sta, kowalencyjnie zamkniêta cz¹steczka, wy-

stêpuj¹ca w cytoplazmie komórki. Ta struktura

przypomina nieco plazmid, z t¹ wszak¿e ró¿-

nic¹, ¿e kaseta nie ma zdolnoœci autonomicznej

replikacji w komórce, a ramka odczytu znaj-

duj¹ca siê w kasecie nie posiada promotora

transkrypcji. W³¹czenie kasety do struktury in-

tegronu nadaje jej zdolnoœæ replikacji i umo¿li-

wia ekspresjê ramki odczytu, któr¹ niesie kase-

ta. Mobilnym elementem integronu jest wiêc

kaseta genowa, a jednoczeœnie wszystkich

funkcji niezbêdnych do jej ekspresji i utrzyma-

nia siê w komórce dostarcza integron. Kaseta

w formie kolistej, która nie zostanie w³¹czona

do struktury integronu, jest nieuchronnie gu-

biona w trakcie podzia³ów komórkowych. Nie-

które opisane integrony maj¹ zdolnoœæ trans-

pozycji, inne lokuj¹ siê w obrêbie transpozo-

nów, wiele integronów znaleziono w plazmi-

dach koniugacyjnych. Cechy te sprawiaj¹, ¿e

integrony lokuj¹ siê na skrzy¿owaniu zjawisk

zwi¹zanych z narastaniem lekoopornoœci

szczepów bakteryjnych i poziomym przekazy-

waniem genów (ang. horizontal gene transfer),

w obszarze podlegaj¹cym bardzo intensyw-

nym badaniom. Dane uzyskane w ostatnich la-

tach wskazuj¹, ¿e poziome przenoszenie mate-

ria³u genetycznego ma ogromne znaczenie dla

ewolucji genomów bakteryjnych i nie ograni-

cza siê do nabywania nowych genów oporno-

œci na antybiotyki.

R ENATA W OLINOWSKA 1,2 ,A LEKSANDER M ASNY 1

354

R ENATA W OLINOWSKA i wspó³aut.

STRUKTURA INTEGRONU

Integron jest stosunkowo niewielk¹ struk-

tur¹ genetyczn¹. Podstawowe jego sk³adowe

to gen intI , koduj¹cy integrazê, sekwencja attI

(ang. attachment site), która wi¹¿e integrazê i

jest miejscem w³¹czania kaset genowych oraz

promotor Pc, który umo¿liwia ekspresjê ramek

odczytu kodowanych przez kasety (Ryc. 1).

Integraza wystêpuje tak¿e w strukturach zwa-

nych superintegronami, które zostan¹ omó-

wione w dalszej czêœci pracy.

Integraza kodowana przez gen intI nale¿y

do rodziny rekombinaz tyrozynowych. Rodzi-

na ta grupuje ponad 100 bia³ek, w tym dobrze

poznan¹ i czêsto opisywan¹ integrazê bakterio-

INTEGRON KLASY 1

5’CS

REGION ZMIENNY

3’CS

intI1

attI1

qac E

sulI

P int

INTEGRON KLASY 3

attI3

intI3

P int

otwarta ramka

odczytu

attC

Ryc. 1. Struktura integronów klasy 1 i 3. Opis w tekœcie.

Kierunki ekspresji genu intI i promotora Pc s¹

odwrotne. Opisan¹ wy¿ej strukturê okreœla siê

jako 5’CS (ang. 5’ conserved segment) — kon-

serwowany segment koñca 5’, jest to obszar

niezbêdny i wystarczaj¹cy dla aktywnoœci inte-

gronu. Kolejne kasety w³¹czane s¹ w miejsce

attI tu¿ za genem intI . Opisano w literaturze

wiele integronów, s¹ to struktury bardzo zró¿-

nicowane, gdy¿ w przyrodzie funkcjonuje wie-

le kaset genowych, które mog¹ byæ w³¹czane

do integronów w dowolnej kolejnoœci. Czêsto

opisuje siê integrony nios¹ce kilka kaset geno-

wych, istniej¹ tak¿e tzw. integrony zerowe, nie

zawieraj¹ce kaset. Najwiêkszy opisany inte-

gron zawiera³ w regionie zmiennym 9 kaset

(N AAS i wspó³aut. 2001). Stabilnym elementem

integronu jest gen intI , koduj¹cy integrazê. Ro-

dzaj integrazy decyduje o tym, do jakiej klasy

zalicza siê dany integron. Trudno podaæ aktu-

aln¹ liczbê klas integronów, gdy¿ zmienia siê

ona szybko wraz z nap³ywem nowych danych.

Dobrze scharakteryzowano integrazy nale¿¹ce

do trzech klas. Lwi¹ czêœæ opisanych dotych-

czas integronów zalicza siê do klasy pierwszej.

Integrony tej klasy s¹ najlepiej zbadane, czêœæ

autorów ma sk³onnoœæ do zawê¿ania pojêcia

integronu do integronów tej klasy. Opisano kil-

ka integronów klasy 2, jeden integron klasy 3.

faga λ . Sekwencje aminokwasowe integraz ko-

dowanych przez integrony ró¿nych klas wyka-

zuj¹ identycznoœæ sekwencji od 45 do 59%, a

podobieñstwo sekwencji 46–72%. W obrêbie

poszczególnych klas integrazy s¹ identyczne

lub prawie identyczne. Dla klasy 1, gdzie anali-

zie poddano wiele genów, identycznoœæ se-

kwencji wynosi 99% (H ALL i wspó³aut. 1999).

Geny kodowane przez integrazy poszczegól-

nych klas oznacza siê jako intI z numerem gru-

py ( intI1 , intI2 , itd.). Aktywnoœæ integraz pole-

ga na rekombinacji umiejscowionej miêdzy

miejscem integracji, zlokalizowanym w inte-

gronie — attI i obszarem oznaczonym jako

59-be (ang. 59-base element) — element piêæ-

dziesiêciodziewiêciozasadowy, wystêpuj¹cym

w kasecie genowej (Ryc. 2).

Miejsca attI , wystêpuj¹ce w strukturze inte-

gronów poszczególnych klas, ró¿ni¹ siê od sie-

bie. Oznacza siê je jako attI z numerem klasy

( attI1 , attI2 , itd.). Poni¿ej opisany zostanie attI1 ,

jako najlepiej scharakteryzowany. Kaseta geno-

wa jest precyzyjnie w³¹czana miêdzyGiTTele-

mentu GTTRRRY (R oznacza resztê pirymidy-

now¹, Y oznacza resztê purynow¹) (Ryc. 2 i 3).

Sekwencja GTTRRRY jest jedynym œladem ho -

mologii miêdzy attI i 59-be , dwiema sekwen-

cjami wykorzystywanymi przez integrazê w

Integrony

355

59-be

cyrkularna kaseta

genowa

GTTRRRY

attI1

gttrrry

59-be

intI1

attI1

3’CS

integron bez kasety

59-be

integraza

(IntI1)

attI gTTRRRY

Gttrrry

59-be

intI1

attI1

3’CS

integron z kaset¹

Ryc. 2. Schemat integracji kasety genowej do miejsca attI1 integronu.

Sekwencja GTTRRRY jest miejscem w³¹czenia kasety, du¿e lub ma³e litery oznaczaj¹ pochodzenie sekwencji od-

powiednio z kasety genowej lub obszaru attI1 integronu. 3’CS oznacza element sta³y wystêpuj¹cy w integronach

klasy 1.

59-be

w obrêbie kolistej kasety genowej

5pz

17-111pz

6pz

RYYYAAC

G TTRRRY

59-be/attC

17-111pz

G ttrrry

attI1

obszar wi¹zania

miejsce proste

G TTRRRY

oko³o 60 pz

G TTRRRY

w formie

struktury szpilki do w³osów

Ryc. 3. Struktura elementu 59-be , 59-be / attC i attI1 .

Na rysunku zaznaczono zasady konserwowane w obrêbie miejsc wi¹zania integrazy, X oznacza dodatkow¹ zasa-

dê obecn¹ w 2L. Strza³ka w obrêbie sekwencji GTTRRRY oznacza miejsce ³¹czenia sekwencji integronu z

cz¹steczk¹ kasety genowej.

59-be/attC

356

R ENATA W OLINOWSKA i wspó³aut.

trakcie w³¹czania lub wycinania kasety. Miej-

sce proste (ang. simple site), do którego wi¹¿e

siê integraza, sk³ada siê z dwóch odcinków o

d³ugoœci 7 pz (par zasad), stanowi¹cych odwró-

cone powtórzenia (Ryc. 3). W obrêbie prawej

sekwencji zachodzi w³¹czanie kasety. Oprócz

miejsca prostego istniej¹ jeszcze dwie sekwen-

cje o d³ugoœci 7 pz wi¹¿¹ce integrazê, pierwsze

okreœla siê jako „mocne”, drugie jako „s³abe”

(na Ryc. 3 oznaczone odpowiednio 1 i 2). Ob-

szar ten funkcjonuje jako wzmacniacz (ang. en-

hancer) procesu wi¹zania integrazy. W obrê-

bie miejsc wi¹¿¹cych integrazê stwierdza siê

obecnoœæ sekwencji GTT, tak jak w obszarze in-

tegracji kasety. Sekwencje wi¹¿¹ce integrazê

maj¹ charakter krótkich sekwencji powtórzo-

nych i prawie nigdy nie s¹ idealnymi powtórze-

niami. Ca³y fragment ma wielkoœæ ok. 60 pz,

choæ opisano tak¿e formy mniejsze, o wielko-

œci ok. 35 pz.

KASETY GENOWE

Kasety genowe nale¿¹ do najmniejszych

znanych ruchomych elementów genetycz-

nych. Ich wielkoœæ waha siê od 400 pz do 1 kpz

(tysi¹c par zasad). Maj¹ bardzo zwart¹ budowê,

sk³adaj¹ siê z otwartej ramki odczytu i obszaru

oznaczonego jako 59-be , który stanowi miejsce

rekombinacji ze struktur¹ attI integronu. Kase-

ty s¹ unikaln¹ ruchom¹ struktur¹ genetyczn¹,

która nie koduje enzymów zaanga¿owanych w

integracjê kasety do DNA bakterii ani enzy-

mów aktywnych przy wycinaniu kaset. Ich in-

tegracja jest zale¿na od tego, czy w komórce

bakteryjnej znajduje siê aktywny gen integrazy.

Kasety genowe wystêpuj¹ w formie liniowej,

jako element integronu, ale mo¿na te¿ wykazaæ

ich istnienie w cytoplazmie komórki jako ko-

walencyjnie zamkniêtej struktury kolistej.

Struktury te s¹ form¹ tymczasow¹ istnienia ka-

set, gdy¿ nie maj¹ zdolnoœci autonomicznej re-

plikacji (R ECCHIA iH ALL 1995).

W zbadanych dot¹d integronach wykryto

ponad 70 ró¿nych kaset genowych. Koduj¹

one bia³ka nadaj¹ce bakteriom opornoœæ na an-

tybiotyki wszystkich podstawowych grup: β -la-

ktamy, aminoglikozydy, makrolidy, trimeto-

prim, rifampicynê i chloramfenikol oraz

czwartorzêdowe zwi¹zki amoniowe. Szczegól-

nie czêsto stwierdza siê obecnoœæ kaset ko-

duj¹cych opornoœæ na aminoglikozydy i trime-

toprim. W obrêbie kaset stwierdzono kilka-

krotnie obecnoœæ ramek odczytu o nie ustalo-

nej funkcji.

Uwa¿a siê, ¿e elementem kasety mo¿e byæ

ka¿da ramka odczytu. Kasety na ogó³ zawieraj¹

jedn¹ ramkê odczytu, choæ w nielicznych przy-

padkach stwierdzono obecnoœæ dwóch ramek.

Zwykle jedna z nich koduje gen opornoœci na

antybiotyk, a druga jest genem o nieznanej

funkcji. Kasety maj¹ zwykle bardzo zwart¹ bu-

dowê. S¹ takie, w których kodon inicjacyjny

ATG (od którego rozpoczyna siê proces trans-

lacji) jest odleg³y zaledwie o 7 pz od struktury

59-be . Kodon terminacyjny (oznaczaj¹cy ko-

niec ramki odczytu) le¿y zwykle bardzo blisko

lub nawet wewn¹trz elementu 59-be . Ekspresja

bia³ka kodowanego przez kasetê zale¿y wiêc

od zewnêtrznego promotora. Je¿eli integracja

kasety nast¹pi do integronu, to promotorem

tym jest Pc, le¿¹cy w obrêbie genu integrazy. Z

tego powodu istotny jest kierunek integracji

kasety. Tylko w jednej, prawid³owej orientacji

mo¿e dojœæ do ekspresji genu kodowanego w

obrêbie kasety. W nielicznych przypadkach ka-

sety zawieraj¹ w³asne sygna³y translacyjne i

transkrypcyjne. Takim wyj¹tkiem jest gen

cmlA , koduj¹cy gen opornoœci na chloramfeni-

kol. Stwierdza siê tutaj obecnoœæ zarówno pro-

motora, jak i sekwencji zaanga¿owanej w ate-

nuacjê (przedwczesn¹ terminacjê transkryp-

cji), która jest zale¿na od obecnoœci chloramfe-

nikolu.

Nazwa element 59-be fragmentu kasety ge-

nowej, odpowiedzialnego za wi¹zanie integra-

zy i w³¹czanie w strukturê integronu, opisuje

wielkoœæ tego obszaru, zaobserwowan¹ w

pierwszych analizowanych kasetach. Opisane

do tej pory struktury 59-be maj¹ d³ugoœæ od 57

pz do 141 pz i charakteryzuj¹ siê ogromn¹ ró¿-

norodnoœci¹ sekwencji. Elementy wspólne dla

tej struktury to dwa regiony o wielkoœci 25-30

pz, zlokalizowane na dwóch koñcach 59-be ,

oznaczane jako RH i LH (ang. right hand, left

hand). Ka¿dy z nich stanowi tzw. simple site,

wi¹¿¹ce integrazê i zawiera dwie sekwencje o

d³ugoœci 7 pz, stanowi¹ce odwrócone powtó-

rzone sekwencje drugiego elementu (Ryc. 3).

Pomiêdzy powtórzonymi sekwencjami, stano-

wi¹cymi miejsca proste, znajduje siê odcinek

DNA o d³ugoœci 5 pz dla LH i 5 lub 6 pz dla RH.

Odcinek oddzielaj¹cy miejsca proste mo¿e

mieæ d³ugoœæ od 17 do 111 pz, to ró¿nice jego

wielkoœci stanowi¹ o zró¿nicowaniu d³ugoœci

Integrony

357

ca³ego elementu 59-be . Obszar ten z³o¿ony jest

z dwóch sekwencji stanowi¹cych d³ugie, od-

wrócone, niedoskona³e powtórzenie (nie zo-

sta³y one zaznaczone na Ryc. 3). Consensus se-

kwencji w obrêbie 59-be dla opisanych dot¹d

kaset genowych jest niewielki. Nieliczne zasa-

dy, które zawsze wystêpuj¹ w obrêbie 59-be ,

zaznaczono na Ryc. 3. Wspólny i sta³y jest nato-

miast schemat budowy tego elementu, pole-

gaj¹cy na istnieniu trzech par odwróconych se-

kwencji powtórzonych. Analiza licznych se-

kwencji 59-be wskazuje, ¿e nacisk selekcyjny

jest po³o¿ony na utrzymanie dostatecznego

stopnia komplementarnoœci pomiêdzy powtó-

rzeniami, a nie na zachowanie okreœlonej se-

kwencji. Najwy¿szy stopieñ komplementarno-

œci posiadaj¹ elementy 1L i 1R, mniejszy 2L i 2R,

komplementarnoœæ odwróconych powtórzeñ,

po³o¿onych miêdzy LH i RH, jest najmniejsza.

Integraza przeprowadza proces w³¹czania

kasety genowej do integronu przez po³¹czenie

sekwencji GTTRRRY obszaru attI i analogicznej

sekwencji elementu 59-be . W efekcie kolista ka-

seta, wystêpuj¹ca jako cz¹steczka bytuj¹ca w cy-

toplazmie, przechodzi w formê liniow¹ (Ryc. 2).

Sekwencja miejsca attI integronu, który w³¹czy³

kasetê, zmienia siê, gdy¿ 6 ostatnich zasad po-

chodzi z w³¹czonej kasety. Sekwencja szeœciu

zasad z 3’ koñca attI staje siê koñcowym obsza-

rem elementu 59-be po integracji. W³¹czenie

kolejnej kasety sprawia, ¿e proces siê powtarza,

sekwencja attI jest ponownie nieco zmieniona.

Miêdzy dwoma w³¹czonymi kasetami powstaje

sekwencja oznaczana attC , bêd¹ca hybryd¹ miê-

dzy elementami 59-be pierwszej i drugiej kase-

ty. Nale¿y zwróciæ uwagê, ¿e w tym procesie nie

dochodzi do duplikacji ¿adnego odcinka zaan-

ga¿owanego w proces integracji. Nie powstaj¹

typowe dla procesu transpozycji proste powtó-

rzenia.

Integraza w sposób preferencyjny w³¹cza

now¹ kasetê w miejsce attI . Mo¿liwa jest jed-

nak tak¿e rekombinacja miêdzy dwoma ele-

mentami attC , a tak¿e miêdzy miejscami attI

ró¿nych integronów. Proces wycinania kaset,

usuwania ich z integronu, zachodzi z udzia³em

sekwencji attI i attC lub dwóch sekwencji attC .

Z niewielk¹ czêstoœci¹ dochodzi do w³¹czania

przez integrazê kasety genowej do DNA poza

integronem. Zachodzi to zwykle w miejscu o

sekwencji GATT, miêdzyAiT.Funkcja tego

procesu nie jest jasna. Kaseta mo¿e znaleŸæ siê

w wielu miejscach w genomie bakterii, gdy¿

krótka sekwencja GATT wystêpuje wiele razy,

kaseta jest w ten sposób zabezpieczona przed

zgubieniem. Jednak ekspresja genu kodowane-

go w kasecie mo¿e zajœæ tylko wtedy, gdy w po-

bli¿u znajdzie siê aktywny promotor. Kaseta

taka nie mo¿e zostaæ wyciêta z miejsca inkor-

poracji, wiêc „wypada” z puli kaset aktywnych

w procesie integracji.

Rekombinazy z rodziny rekombinaz tyrozy-

nowych wymagaj¹ do swej aktywnoœci œciœle

okreœlonej sekwencji nukleotydowej w DNA,

który ma byæ w³¹czany, i w miejscu docelo-

wym. Czêsto przywo³ywanym przyk³adem ta-

kiego procesu jest w³¹czanie bakteriofaga λ do

genomu bakterii, co prowadzi do uzyskania

formy uœpionej, zwanej profagiem. W³¹czanie

DNA fagowego wymaga istnienia tej samej, 15-

nukleotydowej sekwencji w DNA faga i bakte-

rii. Integraza IntI, kodowana przez integrony,

jest bardzo nietypow¹ rekombinaz¹ tyrozy-

now¹. Prowadzi rekombinacjê w miejscu o

specyficznej sekwencji zasad, ale jest w stanie

rozpoznaæ wiele takich sekwencji. Szczególnie

wyraŸnie widaæ to w przypadku obszaru 59-be .

Jak wspomniano wczeœniej, sekwencje nukle-

otydowe tego odcinka s¹ bardzo zró¿nicowa-

ne, a tak zwany consensus, czyli zasady, które

s¹ zawsze obecne w miejscu w³¹czania, to zale-

dwie kilka nukleotydów. Integraza mo¿e

sprawnie dzia³aæ, je¿eli 59-be tworzy okreœlony

uk³ad odwróconych powtórzeñ. Bardzo nie-

wielkie jest te¿ podobieñstwo sekwencji miê-

dzy obszarem attI integronu i elementem

59-be kasety. Nietypowa dla rekombinaz tyro-

zynowych jest tak¿e ogólna struktura 59-be ,za-

wieraj¹ca dwa miejsca proste zamiast jednego.

Opublikowane dotychczas badania wskazuj¹,

¿e integraza IntI sama przeprowadza zarówno

proces integracji, jak i wycinania bez udzia³u

innych enzymów. To tak¿e jest nietypowe,

gdy¿ zwykle oprócz integrazy niezbêdne s¹

bia³ka wspomagaj¹ce, a proces wycinania pro-

wadzi inny enzym. W przypadku faga λ jest to

produkt genu xis , nazywany „ekscisionaz¹” (od

ang. excision — wycinanie).

Transkrypcja otwartych ramek odczytu,

niesionych przez kasety, zachodzi z promoto-

ra Pc. Pc ma charakter bardzo uniwersalnego

promotora, który mo¿e funkcjonowaæ w ko-

mórkach bakterii wielu gatunków. Poszcze-

gólne integrony ró¿ni¹ siê nieco sekwencj¹

Pc, co skutkuje ró¿n¹ jego aktywnoœci¹. W

przypadku niektórych integronów, zw³aszcza

tych o s³abym promotorze Pc, stwierdza siê

obecnoœæ dodatkowego, czêsto silniejszego

promotora. Poziom ekspresji genu kodowane-

go przez kasetê bardzo silnie zale¿y od jej po-

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: