Unieruchamianie rekombinowanej B-galaktozydazy.pdf

PRACE EKSPERYMENTALNE

Unieruchamianie rekombinowanej

Sylwia Wo³osowska, Józef Synowiecki

Katedra Chemii, Technologii i Biotechnologii ¯ywnoœci,

Wydzia³ Chemiczny, Politechnika Gdañska, Gdañsk

Immobilization of recombinant -galactosidase in reactions catalysed

by transglutaminase

Summary

-galactosidase from Escherichia coli transformant containing

the enzyme gene from Pyrococcus woesei was immobilized at pH 5.5 on silica gel

by crosslinking with transglutaminase. The obtained preparations had a specific

activity of 11.573 U/g of support at 70°C using oNPG as a substrate. The opti-

mum pH and temperature for immobilized

-galactosidase activity were 5.5 and

95°C. The immobilized enzyme is stable at the temperatures close to the opti-

mal value and the residual activity for oNPG hydrolysis of the preparations incu-

bated1hin0.1Mphosphate citrate buffer (pH 5.5) at 100°C was about 70% of

the initial value.

-galactosidase, lactose, enzyme immobilization, thermostable enzymes.

Adres do korespondencji

Józef Synowiecki,

Katedra Chemii,

Technologii

i Biotechnologii ¯ywnoœci,

Wydzia³ Chemiczny,

Politechnika Gdañska,

ul. Gabriela Narutowicza

11/12,

80-952 Gdañsk.

1. Wstêp

Katalizowana przez -galaktozydazê lub niektóre -glukozy-

dazy hydroliza zapobiega skutkom nietolerancji laktozy oraz

trudnoœciom technologicznym, wywo³anym wystêpowaniem

tego cukru w mleku i serwatce. Stosuje siê j¹ w celu wytwarza-

nia dietetycznego mleka i jego przetworów, syropów glukozo-

wo-galaktozowych oraz bezlaktozowej serwatki przydatnej do

produkcji lodów, fermentowanych napojów oraz karmy dla

3 (70) 209–220 2005

-galaktozydazy w reakcjach

katalizowanych transglutaminaz¹

Thermostable

Key words:

Sylwia Wo³osowska, Józef Synowiecki

zwierz¹t. Hydroliza laktozy w wymienionych produktach eliminuje niepo¿¹dan¹

krystalizacjê disacharydu w niskiej temperaturze, zwiêksza s³odkoœæ wyrobów

i umo¿liwia fermentacjê rozmaitych produktów ubocznych przemys³u mleczarskie-

go przez drobnoustroje Ÿle przyswajaj¹ce laktozê (1). Wystêpuj¹ce w przypadku

najczêœciej stosowanych -galaktozydaz ograniczenie wydajnoœci procesu wskutek

hamowania reakcji galaktoz¹, gromadz¹c¹ siê podczas hydrolizy laktozy mo¿na

ograniczyæ stosuj¹c reaktory z unieruchomionym enzymem. Niewielkie zmiany

struktury -galaktozydazy, spowodowane wi¹zaniem z noœnikiem, zmniejszaj¹

zdolnoœæ galaktozy do wspó³zawodniczenia z substratem o centrum aktywne enzy-

mu, powoduj¹c zwiêkszenie wydajnoœci reakcji (2). Dodatkow¹ zalet¹ stosowania

unieruchomionego (immobilizowanego) enzymu jest utrwalenie struktury i zwiêk-

szenie stabilnoœci jego cz¹steczek, mo¿liwoœæ wielokrotnego u¿ycia tej samej porcji

preparatu, a w konsekwencji istotnego obni¿enia kosztów produkcji, jak te¿ ³atwe-

go oddzielania enzymu od produktów reakcji. Oprócz wymienionych korzyœci, unie-

ruchamianie powoduje tak¿e niepo¿¹dane efekty, takie jak obni¿enie powinowac-

twa do substratu, charakteryzuj¹ce siê zwiêkszeniem sta³ej Michaelisa (K m ) oraz

zmniejszeniem szybkoœci katalizowanej reakcji (3,4). Jedn¹ z przyczyn tego zjawiska

s¹ opory dyfuzji substratu przez warstwê graniczn¹, oddzielaj¹c¹ unieruchomiony

enzym od œrodowiska reakcji, którym mo¿na przeciwdzia³aæ zwiêkszaj¹c tempera-

turê procesu. Warunkiem tego jest zastosowanie termostabilnych enzymów, umo¿-

liwiaj¹cych ponadto ograniczenie rozwoju niepo¿¹danej mikroflory podczas d³ugo-

trwa³ej pracy reaktora. Ze wzrostem temperatury maleje lepkoœæ roztworu substra-

tu, a tym samym opory przep³ywu, co pozwala na zwiêkszenie natê¿enia przep³ywu

substratu przez reaktor, a w konsekwencji wzrost wydajnoœci procesu. G³ówn¹ ko-

rzyœci¹ wynikaj¹c¹ z zast¹pienia stosowanych obecnie preparatów -galaktozydazy

ich unieruchomionymi termostabilnymi odpowiednikami jest jednak zwiêkszenie

wydajnoœci procesu oraz ograniczenie ryzyka mikrobiologicznego zanieczyszczenia

reaktora. Intensyfikacji czêœciowej cieplnej destrukcji witamin, lipidów, reszt nie-

których aminokwasów w bia³kach oraz przebiegu reakcji Maillarda i innych prze-

mian sk³adników mleka mo¿na zapobiec, ³¹cz¹c hydrolizê laktozy z czêsto stoso-

wan¹ pasteryzacj¹ produktów mlecznych. Funkcjê pasteryzatora spe³ni w tym przy-

padku reaktor przep³ywowy z unieruchomion¹ termostabiln¹ -galaktozydaz¹ (5,6).

Niedogodnoœci¹ wielu stosowanych obecnie metod unieruchamiania enzymów

jest czêœciowa inaktywacja preparatów spowodowana m.in. warunkami reakcji oraz

zmianami struktury cz¹steczek bia³ka pod wp³ywem substancji wi¹¿¹cych enzym.

Rozmaite sposoby trwa³ego unieruchamiania enzymów polegaj¹ najczêœciej na sprzê-

ganiu bia³ka z noœnikiem za poœrednictwem substancji posiadaj¹cych co najmniej

dwie grupy funkcyjne, z których jedna ³¹czy siê kowalencyjnie z enzymem, a druga

z noœnikiem. W przypadku szk³a porowatego, ¿elu krzemionkowego i innych noœni-

ków nie zawieraj¹cych ugrupowañ atomów zdolnych do reagowania z enzymem lub

substancjami wi¹¿¹cymi enzym, stosuje siê m.in. silanizacjê 3-aminopropylo-trie-

toksysilanem, wprowadzaj¹c¹ na powierzchniê noœnika grupy aminowe wi¹¿¹ce

210

PRACE EKSPERYMENTALNE

Unieruchamianie rekombinowanej

-galaktozydazy w reakcjach katalizowanych transglutaminaz¹

bia³ko za poœrednictwem aldehydu glutarowego (7). Obecnie prowadzone s¹ w wie-

lu oœrodkach badania mo¿liwoœci wykorzystania w procesach ci¹g³ych preparatów

uzyskanych przez sieciowanie kryszta³ów enzymu ( Cross-Linked Enzyme Crystals )

(8,9). W celu zmniejszenia oporów dyfuzyjnych konieczne jest jednak ograniczenie

rozmiarów, a szczególnie gruboœci kryszta³ów, co doœæ znacznie utrudnia przep³yw

substratu (8). Mo¿na tego unikn¹æ „sieciuj¹c” rozpuszczalne bia³ko enzymatyczne

po adsorpcji na ¿elu krzemionkowym lub innej niereaktywnej i niedrogiej substancji

o dobrej wytrzyma³oœci mechanicznej.

Celem pracy by³o otrzymanie preparatów termostabilnej -galaktozydazy przy-

datnych w produkcji bezlaktozowego mleka i serwatki. Zamiast stosowanego za-

zwyczaj aldehydu glutarowego do „usieciowania” zaadsorbowanego enzymu wyko-

rzystano transglutaminazê (EC 2.3.2.13), katalizuj¹c¹ tworzenie wi¹zañ amidowych

w reakcjach przeniesienia acylu pomiêdzy grupami -karboksyamidowymi reszt glu-

taminy a pierwszorzêdowymi grupami aminowymi bia³ek lub aktywowanych noœni-

ków. Skutkiem tworzenia tych wi¹zañ powinno byæ ograniczenie desorpcji unieru-

chomionego enzymu poprzez „usieciowanie” jego cz¹steczek miêdzy sob¹ lub

ewentualnie ich trwa³e zwi¹zanie za poœrednictwem grup aminowych aktywowane-

go noœnika.

2. Materia³y i metody

2.1. Stosowane preparaty

-galaktozydazê wyizolowan¹ z komó-

rek Escherichia coli, transformowanych plazmidem pET-30LIC (Novagen Inc., Madi-

son, USA) z wklonowanym genem enzymu z hipertermofilnego archeona Pyrococcus

woesei . Ekstrakt bezkomórkowy pozbawiano termolabilnych bia³ek Escherichia coli

poprzez ich precypitacjê w 85°C, a nastêpnie str¹cano pozostaj¹c¹ w ekstrakcie

-galaktozydazê za pomoc¹ acetonu (10,11). Jako noœniki enzymu stosowano nie-

modyfikowany lub modyfikowany 3-aminopropylo-trietoksysilanem ¿el krzemionko-

wy (Fluka) o rozmiarach ziaren 0,17-0,25 mm charakteryzuj¹cy siê ma³¹ wra¿liwoœ-

ci¹ na zmiany pH, temperatury lub ciœnienia oraz odpornoœci¹ na chemiczn¹ i mikro-

biologiczn¹ degradacjê.

Acylowanie modyfikowanego przez producenta ¿elu krzemionkowego przepro-

wadzano œwie¿o przedestylowanym bezwodnikiem octowym. Próbki zawieraj¹ce

10 ml bezwodnika, 0,1 g ¿elu krzemionkowego i 0,1 g octanu sodu odpowietrzano

5 min w ³aŸni ultradŸwiêkowej i wstrz¹sano przez 1 godz. w 20°C. Otrzymany pro-

dukt s¹czono, przemywano 200 ml wody destylowanej i suszono w 30°C.

BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 209-220 2005

211

Do badañ wykorzystano rekombinowan¹

Sylwia Wo³osowska, Józef Synowiecki

2.2. Unieruchamianie enzymu

Do 1 g noœnika krzemionkowego umieszczonego w kolbie Erlenmayera o pojem-

noœci 200 ml dodawano 25 ml wodnego roztworu rekombinowanej -galaktozydazy

o stê¿eniu 1mg/ml oraz 25 ml roztworu transglutaminazy ze Streptoverticillum

mobaraense (Ajinomoto, Japonia) o stê¿eniu 0,6 mg/ml w 0,2 M buforze fosforano-

wo-cytrynianowym (pH 5,5), odpowietrzano 5 min w ³a¿ni ultradŸwiêkowej, a na-

stêpnie wstrz¹sano przez 1,5 godz. w temperaturze 50°C z szybkoœci¹ 100 cykli/min

przy amplitudzie 5 cm. Badania wp³ywu kwasowoœci mieszaniny reakcyjnej na iloœæ

unieruchomionego enzymu okreœlano stosuj¹c 0,1 M roztwory buforów fosforano-

wo-cytrynianowych o pH zmienianym w zakresie od 3,0 do 8,5. Preparaty odniesie-

nia przygotowywano zastêpuj¹c roztwór transglutaminazy 25 ml 0,2 M buforu fos-

foranowo-cytrynianowego o pH 5,5. Otrzymane preparaty s¹czono pod zmniejszo-

nym ciœnieniem na nuczy ze spiekiem porcelanowym i przemywano kolejno 1-litro-

wymi porcjami: wody destylowanej, 1 M roztworu NaCl oraz ponownie wody. Prze-

mywanie roztworem chlorku sodu zastosowano w celu usuniêcia enzymu zaadsor-

bowanego na noœniku bez udzia³u wi¹zañ kowalencyjnych. Uzyskane preparaty su-

szono przez 12 godz. w temperaturze 20°C.

2.3. Oznaczanie aktywnoœci enzymatycznej

Aktywnoœæ wolnej i unieruchomionej -galaktozydazy oznaczano zmodyfiko-

wan¹ metod¹ Cravena i wsp. (12), okreœlaj¹c iloœæ o-nitrofenolu uwolnionego pod-

czas hydrolizy 5 mM roztworu o-nitrofenylo- -D-galaktopiranozydu (oNPG) w 0,1 M

buforze fosforanowo-cytrynianowym o pH 5,5. W przypadku wolnego enzymu

2,5 ml substratu wstêpnie ogrzewano do 70°C i dodawano 0,5 ml roztworu enzymu

w 0,1 M buforze fosforanowo-cytrynianowym (pH 5,5). Po up³ywie zaplanowanego

czasu reakcji hydrolizê przerywano, dodaj¹c 1 ml 1 M roztworu Na 2 CO 3 i mierzono

absorbancjê (A 420 ) wzglêdem analogicznie ogrzewanej próby odniesienia, zawie-

raj¹cej zamiast roztworu enzymu 0,5 ml buforu fosforanowo-cytrynianowego o pH

5,5.

Aktywnoœæ unieruchomionej -galaktozydazy okreœlano stosuj¹c 10 ml 5 mM

roztworu oNPG w buforze fosforanowo-cytrynianowym ogrzanego do zaplanowanej

temperatury reakcji i dodawano 10 mg preparatu unieruchomionego enzymu. Prób-

ki mieszano przez okreœlony czas z szybkoœci¹ 150 cykli/min przy amplitudzie 5 cm

w termostatowanej wstrz¹sarce i po up³ywie zaplanowanego czasu reakcji przery-

wano hydrolizê dodaj¹c 3,5 ml 1 M roztworu Na 2 CO 3 . Preparat enzymu odwirowy-

wano (5 min, 2000 x g) i mierzono absorbacjê supernatantu (A 420 ) wzglêdem analo-

gicznie ogrzewanego roztworu substratu. Jako jednostkê aktywnoœci przyjêto iloœæ

enzymu hydrolizuj¹c¹ w ci¹gu minuty 1 mol oNPG w temperaturze 70°C w 0,1 M

buforze fosforanowo-cytrynianowym o pH 5,5.

212

PRACE EKSPERYMENTALNE

Unieruchamianie rekombinowanej

-galaktozydazy w reakcjach katalizowanych transglutaminaz¹

2.4. Warunki dzia³ania i termostabilnoœæ unieruchomionej

-galaktozydazy

Zale¿noœæ aktywnoœci enzymu od pH reakcji okreœlano stosuj¹c 5 mM roztwory

oNPG w 0,1 M buforach fosforanowo-cytrynianowych o pH od 3,0 do 8,5. Wp³yw

temperatury na aktywnoœæ preparatów okreœlano wed³ug danych zamieszczonych

w rozdziale 2.3. w 0,1 M buforze fosforanowo-cytrynianowym o pH 5,5, zmieniaj¹c

temperaturê reakcji w zakresie 60-98°C. Oznaczenia aktywnoœci preparatu w tempe-

raturach powy¿ej 98°C prowadzono w szczelnie zamykanych probówkach ogrzewa-

nych w ³aŸni glicerynowej. Termostabilnoœæ unieruchomionej -galaktozydazy

okreœlano mierz¹c zmniejszenie aktywnoœci podczas 60 min inkubacji preparatów

w 0,1 M buforze fosforanowo-cytrynianowym (pH 5,5) w temperaturach 60-110°C.

2.5. Zmiany aktywnoœci preparatu podczas hydrolizy laktozy w reaktorze ko-

lumnowym

Kolumnê (0,7 x 10 cm) z p³aszczem ogrzewanym wod¹ o temperaturze 75°C

wype³niano 4,5 g preparatu -galaktozydazy unieruchomionej na ¿elu krzemionko-

wym. Reaktor zasilano 5% roztworem laktozy w 0,1 M buforze fosforanowo-cytry-

nianowym o pH 5,5. Natê¿enie przep³ywu utrzymywano w zakresie 1,3-1,4 ml/min

stosuj¹c pompê perystaltyczn¹ (Unipan 315, Polska). Do pobierania próbek produk-

tów hydrolizy laktozy u¿ywano kolektora frakcji SF3120 (Merck). Stopieñ hydrolizy

laktozy oznaczano metod¹ Nickersona i wsp. (13) okreœlaj¹c stê¿enie wytworzonej

glukozy i galaktozy za pomoc¹ odczynnika arsenomolibdenowego.

3. Omówienie wyników

W przeprowadzonych doœwiadczeniach wykazano, ¿e zastosowanie transgluta-

minazy pozwala na uproszczenie i obni¿enie kosztu procedury unieruchamiania en-

zymów na ¿elu krzemionkowym. Wynika to z wyeliminowania koniecznoœci modyfi-

kowania wymienionego noœnika 3-aminopropylo-trietoksysilanem, stosowanym

w celu wprowadzenia grup aminowych niezbêdnych w przypadku wi¹zania bia³ka

enzymatycznego za poœrednictwem aldehydu glutarowego. O skutecznoœci propo-

nowanego sposobu immobilizacji œwiadczy wyraŸne ograniczenie spadku aktywnoœ-

ci preparatów -galaktozydazy, unieruchomionej na ¿elu krzemionkowym z udzia³em

transglutaminazy po intensywnym przemywaniu roztworem chlorku sodu, powo-

duj¹cym elucjê enzymu zaadsorbowanego za poœrednictwem oddzia³ywañ jono-

wych, w porównaniu z preparatami kontrolnymi otrzymanymi bez jej stosowania

(tab. 1). Zaobserwowane zwiêkszenie stabilnoœci wi¹zania enzymu nie jest przy-

puszczalnie spowodowane tworzeniem wi¹zañ amidowych pomiêdzy enzymem

a noœnikiem, lecz wynika g³ównie z zachodz¹cego pod wp³ywem transglutaminazy

BIOTECHNOLOGIA 3 (70) 209-220 2005

213

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: