Interferencja RNA.pdf

Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3

PRACA POGLĄDOWA

Magdalena Czajka-Uhryn 1 , Ilona Bednarek 2

1 Katedra i Zakład Biologii Molekularnej i Genetycznej Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach

2 Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach

Interferencja RNA — nowe narzędzie

molekularne w modulacji zjawiska

oporności wielolekowej

RNA interference — a new molecular tool in MDR modulation

ABSTRACT

The multidrug resistance (MDR), intrinsic or acquired, is nowadays one of the major reasons for chemotherapeutic

treatment failure in many cancer patients. The etiology of MDR is rather multifactorial, but often the classical MDR is

associated with the overexpression of the plasma membrane ABC (ATP-binding cassette) transporters, resulting in

increased efflux of the drugs from the cancer cells. In the last few years a vast number of strategies have been

proposed and tested to reverse the MDR. One of the most promising methods for modulation of the classical MDR

phenotype is RNA interference (RNAi). RNAi is a conserved biological response to dsRNA, which results in sequence-

specific gene silencing. The RNAi is a powerful tool, which gives an opportunity for highly specific inhibition

of expression of the individual ABC transmembrane proteins. The results obtained from the experiments in the preclini-

cal models with the usage of RNAi are very encouraging. It gives hope that the MDR problem will finally be overcome.

KEY WORDS: multidrug resistance (MDR), RNA interference (RNAi), Post-transcriptional Gene Silencing (PTGS)

STRESZCZENIE

Oporność wielolekowa, zarówno pierwotna jak i nabyta, jest obecnie jedną z głównych przyczyn niepowodzenia terapii

nowotworów. Etiologia oporności wielolekowej jest wieloczynnikowa, jednak klasyczną oporność wielolekową wiąże

się najczęściej z nadmierną ekspresją transporterów błonowych należących do rodziny białek ABC ( ABC family ),

których nadekspresja powoduje nadmierny wyrzut leków z komórek nowotworowych i zmniejszenie skuteczności terapii.

W ostatnim czasie opracowano i testowano liczne strategie mające na celu zwalczanie oporności wielolekowej nowo-

tworów. Ostatnio jedną z najbardziej obiecujących metod terapii okazała się interferencja RNA, określana jako RNAi.

Jest to etiologicznie konserwatywna odpowiedź komórki na krótki, 2-niciowy RNA (dsRNA), prowadząca do specyficz-

nej, zależnej od sekwencji dsRNA inhibicji ekspresji homologicznego genu. Technika RNAi umożliwia specyficzne

zahamowanie ekspresji białek uczestniczących w powstawaniu fenotypu MDR. Rezultaty eksperymentów przeprowa-

dzanych w warunkach in vitro z wykorzystaniem techniki RNAi okazały się bardzo zachęcające. Daje to nadzieje

na szybsze i skuteczniejsze rozwiązanie problemu oporności wielolekowej u pacjentów z chorobami nowotworowymi.

SŁOWA KLUCZOWE: oporność wielolekowa, interferencyjny RNA (RNAi), potranskrypcyjne wyciszanie

ekspresji genów (PTGS)

Adres do korespondecji:

Dr n. biol. Ilona Bednarek

Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej Śl. AM

ul. Narcyzów 1, 41–200 Sosnowiec

Tel./faks:(+48 32) 291 74 66

e-mail: dribednarek@slam.katowice.pl

Annnales Academiae Medicae Silesiensis 2005, 59, 3, 209–218

ISSN 0208–56077

209

Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3

Wstęp

na celu ochronę komórek przed wniknięciem do ich wnę-

trza egzogennych substancji toksycznych, co potencjalnie

mogłoby doprowadzić do śmierci komórki. Ze względu na

posiadane funkcje transportery rodziny ABC lub ich ana-

logi można spotkać w wielu organizmach nie tylko ludz-

kich, ale i zwierzęcych, roślinnych czy bakteriach. Trans-

portery ABC występują w różnych tkankach (np. płuca,

łożysko, jelito, mózg, serce, nerki). Białka rodziny ABC

mogą przenosić różne substraty, włączając jony, hormo-

ny, lipidy, leki i inne ksenobiotyki [5]. Charakterystykę

wybranych białek należących do rodziny ABC oraz białka

oporności płuc (LRP, lung resistance-related protein ), któ-

remu również przypisuje się udział w powstawaniu feno-

typu MDR, przedstawiono w tabeli I.

W organizmie ludzkim transportery ABC pełnią bar-

dzo ważne funkcje fizjologiczne. Eliminacja ksenobioty-

ków i toksyn jest niezbędna dla prawidłowego funkcjono-

wania komórek wątroby, nerek czy układu pokarmowe-

go. Ponadto białka transporterowe uczestniczą w regula-

cji przepuszczalności komórek łożyska i ośrodkowego ukła-

du nerwowego, będąc głównym elementem barier: łoży-

skowej i krew–mózg; tym samym zapobiegają one ekspo-

zycji wrażliwych komórek nerwowych oraz komórek roz-

wijającego się płodu na szkodliwe czynniki cytotoksyczne

[2]. Białka ABC uczestniczą także w licznych procesach

metabolicznych, a mutacja w obrębie genów kodujących

te białka może prowadzić do poważnych chorób metabo-

licznych. Przykładami mogą być dziedziczny niedobór biał-

ka oporności wielolekowej 2 (MRP, multidrug resistance-

associated protein ) powodujący syndrom Dubina-Johnso-

na, czy też niedobór MRP6, prowadzący do pseudoxan-

thoma elasticum — wielosystemowego zaburzenia ataku-

jącego skórę, oczy i naczynia krwionośne [5]. Budowa

transporterów ABC jest ściśle podporządkowana pełnio-

nym przez nie funkcjom i wykazywanym własnościom, dla-

tego białka te mają w swej sekwencji aminokwasowej za-

wsze miejsce przyłączania ATP ( Walker motifs ), występu-

jące w obrębie cytozolowej domeny wiążącej nukleotydy

(NBD, nucleotide binding domain ) oraz kilka tandemo-

wych powtórzeń hydrofobowych domen transbłonowych,

przybierających formy segmentów lub helis (TMD, trans-

membrane domains ). Sekwencje te są ułożone naprzemien-

nie [8]. Domena transbłonowa jest zaangażowana w przy-

łączanie substratu i jego efluks, domena wiążąca nukle-

otydy przyłącza ATP i uczestniczy w jego hydrolizie [4].

W organizmach eukariotycznych większość białek ABC

ma zwykle 4 domeny, np. glikoproteina P ma strukturę:

NH2-TMD1-NBD1-TMD2-NBD2-COOH. Mniejsza gru-

pa białek rodziny ABC, określana mianem półtranspor-

terów, ma pojedynczą domenę transbłonową i wiążącą

nukleotydy. Do tej grupy należy m.in. białko oporności

raka piersi (BCRP, breast cancer resistance protein ): NH2-

-TMD1-NBD1-COOH [1]. Rodzinę białek ABC podzie-

lono zależnie od występujących podobieństw w budowie

domen transbłonowych i miejsc przyłączania nukleotydów.

Pierwszym opisanym transporterem błonowym, które-

go nadekspresja wykazywała związek z powstaniem

Choroby nowotworowe obecnie zalicza się do jednej

z najczęstszych przyczyn zgonów wśród populacji ludzkiej.

Wysoka śmiertelność często jest spowodowana zbyt późną

lub nietrafną diagnostyką samej choroby oraz wciąż nie-

dostatecznie efektywną terapią. Są to między innymi przy-

czyny, dla których wielu badaczy i lekarzy skupia się na

opracowaniu skutecznej i wydajnej terapii nowotworów

zmniejszającej śmiertelność chorych.

Chemioterapia zajmuje ważne miejsce w leczeniu cho-

rób nowotworowych. Często obserwuje się dalszy wzrost

komórek nowotworowych w obecności zastosowanego

chemioterapeutyku lub całej grupy zastosowanych związ-

ków. Wiąże się to głównie z wytworzeniem tzw. mecha-

nizmu oporności wielolekowej komórek nowotworowych.

Oporność wielolekowa (MDR, multidrug resistance ) to

swego rodzaju „fenomen” komórek nowotworowych,

dzięki któremu komórki eksponowane na działanie jed-

nego czynnika chemioterapeutycznego rozwijają opor-

ność krzyżową w stosunku do dużej grupy ksenobioty-

ków niezwiązanych ze sobą pod względem budowy struk-

turalnej i funkcjonowania [1, 2]. W niektórych typach

nowotworów obserwuje się również tzw. pierwotną opor-

ność wielolekową, objawiającą się bez wcześniejszej eks-

pozycji na chemioterapeutyki [2]. Dotychczas nie pozna-

no całkowicie podstaw mechanizmu MDR, wiadomo jed-

nak, że etiologia fenotypu MDR jest złożona i wieloczyn-

nikowa [2]. Oporność wielolekowa może zależeć m.in.

od: nadmiernej aktywacji enzymów detoksykacyjnych, za-

burzeń w przekierowywaniu cyklu komórkowego na szlak

apoptotyczny (np. mutacje w obrębie genu p53, zachwia-

na równowaga białek pro- i antyapoptotycznych), nasi-

lonego efluksu ksenobiotyków z komórki docelowej za

pośrednictwem transporterów błonowych, czy wreszcie

zmniejszonego wychwytu leku ze środowiska zewnątrz-

komórkowego [1, 3]. Uważa się, że tylko dogłębne po-

znanie mechanizmu plejotropowej oporności pozwoli ją

pokonać, a tym samym zwiększy zakres działania dotych-

czas stosowanych leków cytotoksycznych oraz umożliwi

syntezę nowych leków odpowiednio zmodyfikowanych

w celu „omijania” problemu oporności wielolekowej.

Białka transportowe błon komórkowych

jako główne czynniki odpowiedzialne

za zjawisko oporności wielolekowej

Etiologię klasycznej oporności wielolekowej najczęściej

łączy się z nadmierną ekspresją i nieprawidłowościami

w funkcjonowaniu białek transportowych błon komórko-

wych [2]. Białka te należą do nadrodziny białek ABC (ATP-

biniding cassette ), których aktywność zależy od energii

powstałej z hydrolizy ATP ( adenosine triplosphate ) [4].

Białka ABC są osadzone w błonach plazmatycznych i dzia-

łają jak pompy-transportery przenoszące określone sub-

straty przez błonę wbrew gradientowi stężeń do środowi-

ska zewnętrznego [1]. Działanie białek transportowych ma

210

Magdalena Czajka–Uhryn i wsp., RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

Tabela I. Charakterystyka wybranych transporterów rodziny ABC i białka LRP zaagażowanych w powstawanie fenotypu MDR, przykłady

ich substratów i miejsc wystepowania [5–7]

Table I. Characteristics of LRP protein and chosen ABC transporters involved in MDR phenotype forming; substrates and localization [5–7]

Gen

Alternatywna nazwa

Przykłady substratów

Przykłady miejsca występowania

MDR1

ABCB1, PGY1, P-GP

Kolchicyna, doxorubicyna,

Tkanki o funkcji sekrecyjnej

winblastyna, winkrystyna

MRP1

ABCC1

Kolchicyna, etopozyd, VP16

Płuca, jądra

MRP2

ABCC2, cMOAT

Winblastyna, sulfinpyrazon

Wątroba, jelito, nerki

MRP3

ABCC3

Metotreksat, etopozyd

Nerki, jelito

MRP4

ABCC4

Puryny i analogi nukleozydów

Powszechnie w wielu tkankach

MRP5

ABCC5

Puryny i analogi nukleozydów,

Wątroba, powszechnie w wielu tkankach

mitoxantron, topotecan, doxorubicyna

MRP6

ABCC6

Etopozyd, doxorubicyna

Wątroba, nerki

MRP8

ABCC11

5-FU, ddC, PMEA

Wątroba, gruczoły piersiowe

BCRP

ABCG2, MXR1, ABCP

Topotekan, daunorubicyna, doxorubicyna

Mózg, nerki, płuca, serce

LRP

Daunorubicyna

Nabłonek oskrzeli, jelito,

komórki okładzinowe żołądka, kanaliki

proksymalne nerek, kora nadnerczy

MDR ( multidrug resistance ) — oporność wielolekowa; MRP ( multidrug resistance-associated protein ) — białka oporności wielolekowej; BCRP ( breast cancer

resistance protein ) — białka oporności raka piersi; LRP ( lung resistance-related protein ) — białka oporności płuc

oporności wielolekowej, była glikoproteina P (P-gp opisy-

wana również jako PGY1, MDR1, ABCB1). Jest ona zbu-

dowana z 2 domen transbłonowych (każda złożona z 6 seg-

mentów transbłonowych), które oddziałują z wieloma obo-

jętnymi lub dodatnio naładowanymi substancjami hydro-

fobowymi. Zbliżoną budową charakteryzują się także biał-

ka MRP4 i MRP5, podczas gdy MRP1, MPR2, MRP3 oraz

MRP6 mają 5 dodatkowych segmentów transbłonowych

na N-końcu [5]. Dotychczas poznano i opisano 48 białek

należących do rodziny ABC. W przypadku 10 białek udo-

wodniono ich ścisły związek z powstawaniem oporności

wielolekowej (np. MDR1, MRP1-6, BCRP), podczas gdy

nadekspresję 2 innych białek łączy się z powstawaniem

fenotypu MDR [2]. W przypadku posiadania przez ko-

mórkę fenotypu oporności wielolekowej, związanego z nad-

ekspresją białek rodziny ABC, dochodzi do nadmierne-

go, niekontrolowanego wyrzutu substancji egzogennych

z komórki za pośrednictwem transporterów ABC. Powo-

duje to znaczny spadek akumulacji leku w przestrzeni wew-

nątrzkomórkowej, co prowadzi do zmniejszenia ilości te-

rapeutyku mogącego osiągnąć swoje miejsce docelowe.

Ostatecznie obserwuje się spadek skuteczności leku

i w efekcie terapia jest nieskuteczna. Przyczyną nasilone-

go efluksu może być nadmierna ekspresja białek trans-

portowych. Według Scotto oporność wielolekową nowo-

tworu, związaną z nadekspresją białka P-gp, można po-

dzielić zależnie od mechanizmu jej powstania na 3 typy:

oporność pierwotną, nabytą i przejściową [5]. Pierwotna

oporność wiąże się z nasiloną konstytutywną ekspresją

genu MDR1 w komórkach; może ona wynikać z charak-

teru tkanki, z której wywodzi się nowotwór, lub też być

rezultatem zmian w ekspresji genu represyjnego dla genu

MDR. W tym przypadku chemioterapia ma mały wpływ

na rozwój fenotypu MDR. Oporność nabyta powstaje na

bazie komórek nowotworowych pierwotnie wrażliwych na

chemioterapię. W czasie leczenia dochodzi do pojawienia

się i wzrostu subpopulacji zmutowanych komórek, cechu-

jących się nadekspresją glikoproteiny P. W tym przypadku

chemioterapia eliminuje tylko wrażliwe komórki, a zmu-

towana grupa komórek pozostaje i nadal się rozwija. Trzeci

typ oporności, określany też jako indukowany, dotyczy

komórek nowotworowych pierwotnie wrażliwych na leki,

które nagle pod wpływem stosowanej chemioterapii in-

dukują nasiloną ekspresję genu MDR1, co pozwala im na

przetrwanie terapii i dalszy rozwój [5]. Inną przyczyną

nasilonego wyrzutu leku z komórek może być nieprawi-

dłowa ekspresja białek rodziny ABC. Zmieniona, wadli-

wa ekspresja białek transportowych może tłumaczyć fakt

istnienia tak dużej rozbieżności w budowie strukturalnej

substratów przenoszonych przez jeden transporter. Doy-

le i Ross potwierdzili, że mutacja w obrębie białka BCRP

w pozycji 482 polegająca na wymianie aminokwasu (argi-

niny na treoninę lub glicynę) zmienia specyficzność sub-

stratową tego białka [1]. Wystąpienie u pacjenta oporno-

ści komórek nowotworowych wobec przyjmowanego leku

wymusza zwiększenie stosowanej dawki leku lub włączenie

do terapii dodatkowych, farmakologicznie aktywnych czyn-

ników w celu uzyskania pożądanego efektu terapeutycz-

211

Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3

nego. To jednak automatycznie wiąże się ze wzrostem tok-

syczności i zwiększeniem działań niepożądanych terapii.

cyficzne komponenty (np. kompleks przenoszący sygnał

zainicjowany przez stymulację metaboliczną lub środowi-

skową) [5]. Konstytutywna ekspresja niektórych białek, np.

glikoproteiny P lub MRP, może w niektórych komórkach

podlegać regulacji przez komponenty zaangażowane

w transformację nowotworową komórki. Istnieją donie-

sienia potwierdzające fakt, że forma dzika białka p53 może

wyciszać transkrypcję genu MDR1, podczas gdy całkowi-

ta inhibicja ekspresji białka p53 lub obecność w komórce

niektórych mutantów białka p53 może aktywować ekspre-

sję genu MDR1 [13–15]. Ponadto induktorami ekspresji

białka P-gp mogą być: metale ciężkie, szok termiczny, sta-

ny zapalne, kancerogeny, hipoksja oraz promieniowanie

X i UV [5, 16].

Alternatywnym sposobem modulowania ekspresji bia-

łek rodziny MDR jest inhibicja zachodząca na poziomie

translacji. W tym przypadku celem modulacji staje się

matrycowy RNA znajdujący się w cytoplazmie. Dotych-

czasowe próby inhibicji translacji polegały m.in. na wpro-

wadzaniu do komórki specjalnie zaprojektowanych oligo-

nukletydów antysensownych, które posiadają sekwencję

komplementarną do wybranego odcinka mRNA, przyłą-

czają się do niego, uniemożliwiając syntezę łańcucha pep-

tydowego [12, 17]. Inną techniką wyciszania genów docelo-

wych na poziomie mRNA jest stosowanie rybozymów, czyli

oligonukleotydów o właściwościach katalitycznych. Oligo-

nukleotydy te, odpowiednio zaprojektowane, przyłączają się

do docelowego mRNA i dzięki posiadanej aktywności en-

donukleazy przecinają łańcuch nukleotydowy mRNA, unie-

możliwiając tym samym syntezę określonego białka.

Nową, konkurencyjną i, jak się często podkreśla, bar-

dziej wydajną i specyficzną techniką wyłączania genów jest

metoda interferencji RNA (RNAi, RNA interference ).

Mimo że jest to stosunkowo nowa metoda, to jej wysoka

specyficzność i potencjalne możliwości zastosowania w na-

uce i medycynie budzą coraz większe zainteresowanie.

Świadczyć o tym może ciągle rosnąca liczba publikacji na-

ukowych poświęconych tematyce RNAi, np. liczba wyszu-

kanych artykułów w bazie internetowej PubMed

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) na hasło „RNA interferen-

ce” w 1998 roku wynosiła 5 publikacji, w 2000 roku — 71,

a w 2003 roku — już 898 i obecnie liczba ta nieustannie

wzrasta. Warto również uwzględnić fakt, że czasopismo

„Science” uznało odkrycie RNAi za przełomowe wyda-

rzenie 2002 roku.

Możliwości tłumienia zjawiska oporności

wielolekowej. Chemouczulacze

W związku z coraz częstszym pojawianiem się oporno-

ści nowotworu na stosowane chemioterapeutyki, koniecz-

ne okazało się poszukiwanie nowych strategii terapii w celu

odwrócenia czy zapobiegania oporności wielolekowej [9].

Duże nadzieje wiązano z tzw. terapią objawową, polega-

jącą na opracowaniu czynnych farmakologicznie modula-

torów MDR, tzw. chemouczulaczy, których działanie spro-

wadza się do inhibicji funkcjonowania pomp-transporte-

rów, a tym samym — zmniejszania wyrzutu leku z komór-

ki. Działanie stosowanych chemouczulaczy często spro-

wadza się do wypierania leków z ich połączeń z pompami

na podstawie mechanizmu inhibicji konkurencyjnej [10].

Do najczęściej stosowanych inhibitorów MDR stosowa-

nych w warunkach in vitro należą blokery kanałów wap-

niowych, antagoniści kalmoduliny, peptydy hydrofobowe,

antybiotyki, inhibitory kinazy białkowej, pochodne hor-

monów lub flawonidy [11]. Dużą przeszkodą w wykorzy-

stywaniu modulatorów MDR okazała się konieczność sto-

sowania ich w bardzo dużych dawkach w celu uzyskania

niezbędnego wewnątrzkomórkowego stężenia prowadzą-

cego do ujawnienia się ich działania cytotoksycznego [12].

Duże dawki chemouczulaczy mogą jednak powodować

wiele poważnych działań niepożądanych terapii, jak np.

zaburzenia przewodzenia w komórkach mięśnia sercowe-

go, hipotensja, hiperbilirubinemia, czy immunosupresja

[12]. Dodatkowo wiele modulatorów MDR oddziałuje

z innymi białkami transportującymi oraz licznymi układa-

mi enzymatycznymi (np. wywołują izoenzym 3A4 cytochro-

mu p450), prowadząc do nieprzewidywalnych interakcji

farmakokinetycznych [4]. Innym niezwykle istotnym utrud-

nieniem terapii z udziałem chemouczulaczy stało się wy-

twarzanie przez niektóre nowotwory tzw. trzeciorzędowej

oporności, w tym wypadku skierowanej wobec stosowa-

nych modulatorów MDR [12].

Regulacja zjawiska oporności wielolekowej

na poziomie ekspresji genów

Ze względu na liczne przeszkody w modulowaniu zja-

wiska MDR na poziomie białek zaangażowanych w ten

proces alternatywą stała się terapia przyczynowa, obejmu-

jąca regulację ekspresji białek ABC. Regulacja procesu

transkrypcji wiąże się z zastosowaniem inhibitorów wią-

żących się z matrycowym DNA (np. oligonukletydów, bia-

łek, związków chemicznych) lub modulacją działania re-

gulatorów transkrypcji. Regulacja transkrypcji jest proce-

sem bardzo złożonym, gdyż każda grupa genów podlega

regulacji przez wyspecjalizowany, wielobiałkowy kompleks

zawierający zarówno wspólne, podstawowe komponenty

(np. czynniki transkrypcyjne), jak również unikatowe, spe-

Metoda RNAi — regulator ekspresji genów

Pierwsze doniesienia o możliwości wyciszania genów

przy udziale RNA opublikowano w połowie lat 90. XX

wieku. Wówczas Guo i Kemphus oświadczyli, że po wpro-

wadzeniu do organizmu nicienia Caenorhabditis elgans

mieszaniny sensownego i antysensownego RNA zaobser-

wowali wyciszenie odpowiedniego, komplementarnego

genu. Tę informację zgłębił Fire, który wraz ze współpra-

cownikami w 1998 roku ogłosił, że to właśnie 2-niciowy

212

Magdalena Czajka–Uhryn i wsp., RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNA odpowiada za proces wyciszania genów w Caenor-

habditis elegans [18]. Od tego czasu w celu pełniejszego

opisania eksperymentalnego wykorzystania RNA do in-

hibicji ekspresji nowo odkrytą metodę zaczęto określać

mianem RNA interference (RNAi). Mechanizm RNAi za-

obserwowano również w organizmach roślin, niektórych

bezkręgowców i kręgowców. Następnie dowiedziono, że

jest to ewolucyjnie konserwatywny mechanizm obecny od

dawna w świecie zwierzęcym i roślinnym [9, 19]. Fizjolo-

giczna rola mechanizmu RNAi sprowadza się głównie do

ochrony genomu komórki gospodarza przed inwazją mo-

bilnych nośników informacji genetycznej, takich jak trans-

pozony czy wirusy [19–23]. Podejrzewa się również, że

cząstki 2-niciowego RNA zaangażowane w mechanizm

RNAi mogą odpowiadać za metylację wybranych sekwen-

cji promotorowych DNA, hamując w ten sposób transkryp-

cję wybranych genów [24–26]. Możliwe, że metylacja DNA

ma na celu inhibicję rozwoju retrowirusów, których mate-

riał genetyczny zintegrował się z genomem zainfekowa-

nej komórki [27]. W ostatnio prowadzonych badaniach na

komórkach drożdży dowiedziono, że mutanty pozbawio-

ne komponentów niezbędnych do istnienia zjawiska RNAi

tracą zdolność do metylacji chromatyny i supresji trans-

pozonów w genomie [28]. Może to sugerować wpływ me-

chanizmu RNAi na strukturę chromatyny w jądrze komór-

kowym. Jak dotąd w pełni nie poznano mechanizmu dzia-

łania RNAi. Pierwsze obserwacje przebiegu RNAi po-

twierdzały istnienie korelacji między destabilizacją mRNA

komplementarnego

Uważa się, że enzymy RNazy III działają jako dimery, dla-

tego DICER dzięki posiadanym dwóm domenom RNazy

III może katalizować jednorazowo przerwanie wiązań fos-

fodiestrowych kwasu nukleinowego w 4 miejscach, two-

rząc w ten sposób siRNA o typowej charakterystyce. Do-

tychczas odkryte enzymy RNazy III nie wymagały do swo-

jego funkcjonowania energii czerpanej z hydrolizy ATP,

tym bardziej może zastanawiać obecność domeny ATP-

-zależnej w strukturze DICER. Jednak domena helikazo-

wa może sugerować konieczność chwilowego rozdziele-

nia nici dsRNA tuż przed przecięciem 2-niciowego RNA

[33]. Alternatywnie ATP może regulować przyłączanie się

DICER do dsRNA lub modulować aktywność domeny

katalitycznej. Należy jednak podkreślić, że badania pro-

wadzone przez Nykänen i wsp. jednoznacznie wskazują

na udział energii pochodzącej z rozpadu ATP w procesie

generowania krótkich siRNA [34]. Różnice w długościach

powstających małych interferencyjnych RNA (21–25 nu-

kleotydów) u różnych organizmów mogą wynikać z typo-

wych dla danego gatunku zmian w domenach katalitycz-

nych enzymu DICER [35]. W przypadku ludzkich komó-

rek niestety nie jest możliwe zainicjowanie zjawiska RNAi

przez wprowadzenie długołańcuchowego dsRNA. Prze-

szkodą jest indukcja w komórkach większości ssaków nie-

specyficznej odpowiedzi interferonowej. Odpowiedź in-

terferonowa jest swego rodzaju mechanizmem obronnym

komórek, uruchamianym m.in. w czasie infekcji wiruso-

wych. W odpowiedzi tej wprowadzony obcy materiał ge-

netyczny aktywuje kinazę białkową zależną od dsRNA

(PKR, dsRNA-dependent protein kinase ) oraz 2’,5’-oligoA

syntetazę (2’,5’-AS) [36–38]. Aktywna forma PKR powo-

duje zahamowanie translacji poprzez fosforylację małej

podjednostki eukariotycznego czynnika inicjacji trans-

lacji eIF2a, a zaaktywowana 2’,5’-AS katalizuje proces

degradacji mRNA za pośrednictwem rybonukleazy L [36–

–38]. Zainicjowana inhibicja ekspresji genów ma charak-

ter niespecyficzny i nie zależy od sekwencji wprowadzo-

nego długoniciowego dsRNA, a częstym jej następstwem

jest szybka śmierć komórki (zarówno na drodze apopto-

zy, jak i na ścieżce nieapoptotycznej) [22]. Ścieżki interfe-

ronowej nie stwierdzono w niezróżnicowanych komórkach

embrionalnych, co umożliwiło zainicjowanie specyficzne-

go wyciszania ekspresji genów za pomocą długiego dsR-

NA w mysich oocytach lub embrionach, jak również ko-

mórkach nowotworowych wywodzących się z komórek em-

brionalnych [38, 39]. Ta ostatnia informacja jest bardzo

istotna dla prowadzenia dalszych badań nad nowotwora-

mi wywodzącymi się z tego typu komórek. Kittler i Buch-

holz w swoich badaniach stwierdzili, że minimalna dłu-

gość dsRNA, która indukuje śmierć komórki w następ-

stwie odpowiedzi interferonowej dla komórek ssaków,

wynosi 30 par zasad [40]. Przeszkodę tę ostatecznie poko-

nano, wprowadzając do komórek gotowe, laboratoryjnie

syntetyzowane 21- 22-nukleotydowe siRNA [20, 22].

Etap efektorowy, obejmujący degradację mRNA, za-

chodzi w cytoplazmie, w przeciwieństwie do etapu inicju-

dsRNA do komórki [29, 30].

Obecnie wiadomo, że RNAi przebiega w komórkach

w 2 etapach: inicjacyjnym i efektorowym. Mechanizm

RNAi zostaje w komórce zainicjowany przez enzym nale-

żący do rodziny RNazy III. Enzym ten specyficznie tnie

wprowadzoną do komórki, długą, 2-niciową cząsteczkę

RNA (zarówno pochodzenia egzo- lub endogennego) na

krótkie, długości rzędu 21–23 nukleotydów dsRNA

(dsRNA, double stranded RNA ) [23, 31]. Powstałe krótkie

oligonukleotydy, określane mianem siRNA (siRNA, short

interefering RNA ), mają po 2–3 niesparowane nukleotydy

na każdym końcu 3’ (tzw. lepkie końce), grupę fosfora-

nową na końcach 5’ oraz hydroksylową na końcach 3’. Jed-

na z nici siRNA, określana jako antysensowna, ma sekwen-

cję nukleotydów komplementarną do sekwencji mRNA

wybranego odcinka docelowego genu. Taka budowa po-

wstałych krótkich, interferujących oligonukleotydów RNA

(siRNA) jest niezbędna do prawidłowego przebiegu eta-

pu efektorowego [32]. Enzym katalizujący reakcję „cię-

cia” długiego dsRNA należy pod względem swojej budo-

wy do III klasy enzymów RNazy III. Rodzina enzymów

III klasy, nazwana DICER, jest ewolucyjnie konserwatyw-

na i można ją znaleźć w wielu organizmach w świecie roś-

linnym i zwierzęcym [33]. Rodzina DICER składa się

z N-końcowej domeny helikazowej, zależnej od ATP, do-

meny PAZ ( Piwi/Argonaute/Zwille ), podwójnej domeny

RNazy III i domeny przyłączającej dsRNA (dsRBD) [33].

213

wprowadzaniem

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: