Dentosept a Helicobacter pylori.pdf

PRACE DOŚWIADCZALNE

Anna Kędzia 1 , Maria Wierzbowska 1 , Andrzej Kufel 2

Działanie Dentoseptu i Dentoseptu A na pałeczki Helicobac-

ter pylori

Katedra Mikrobiologii, Zakład Mikrobiologii Jamy Ustnej AM w Gdańsku

Kierownik Katedry i Zakładu: prof. dr hab. Anna Kędzia

Oddział Chirurgii Naczyniowej, Szpital Swissmed, Gdańsk

THE ACTIVITY OF DENTOSEPT AND DENTOSEPT A AGAINST HELICOBACTER PYLORI RODS

SUMMARY

The sensitivity to Dentosept and Dentosept A (Phytopharm, Klęka) 12 strains of Helicobacter pylori isolated

from gingival pocket (7 strains) and carotid atherosclerotic plaques (5 strains) were investigated. The sensitivity

were determined by means of plate dilution technique in Brucella agar, supplemented with 5% defibrynated

sheep blood. Inoculum containing 10 5 CFU per spot were seeded with Steers replicator upon the surface of agar.

Incubation plates was performed for 48 h at 37ºC in microaerophilic conditions in anaerobic jars containing

Campy Pak. The MIC was defined as the lowest concentration of Dentosept or Dentosept A inhibiting the growth

of Helicobacter pylori strains. The results of the dates showed, that both drugs were active against evaluated

rods. Dentosept inhibited of 67% of H. pylori strains at concentrations of 1,2-20 mg/ml. Dentosept A was active

against 83% of H. pylori strains (MIC in range 1,2-20 mg/ml). Dentosept A was more active than Dentosept

against the rods tested.

KEY WORDS: HELICOBACTER PYLORI – ANTIBACTERIAL ACTIVITY – INFECTION OF ORAL CAVITY –

ATHEROSCLEROTIC PLAQUE – DENTOSEPT – DENTOSEPT A

Pod koniec XIX wieku Jaworski jako pierwszy szczegółowo opisał spiralne bakterie

występujące w popłuczynach żołądkowych. Jednak kontynuowane przez różnych badaczy

przez wiele lat badania nie doprowadziły do wyhodowania tych drobnoustrojów. Dopiero w

1982 roku Marshall i Warren (1) wyhodowali z błony śluzowej żołądka pacjentów z chorobą

wrzodową Gram-ujemną urzęsioną pałeczkę, którą początkowo włączono do rodzaju Campy-

lobacter i nazwano Campylobacter pyloridis (1). W 1989 roku, po szczegółowych badaniach

morfologicznych i fizjologicznych, zdecydowano o utworzeniu nowego rodzaju – Helicobac-

ter i umieszczeniu w nim pałeczki z nową nazwą gatunkową, jako Heclicobacter pylori (2).

Pałeczka ta rośnie w warunkach mikroaerofilnych (10% C0 2 , 5% 0 2 i 85% N 2 ). Jej hodowla

jest bardzo trudna, ponieważ forma wydłużona szczególnie w warunkach in vitro łatwo prze-

chodzi w postać ziarniakopodobną. Obecnie podejmowane są próby wyhodowania tych ziar-

niakopodobnych form na podłożach sztucznych. Dotychczas udało się jedynie przez krótki

czas utrzymać formy ziarniakowe przy życiu , po umieszczeniu ich w odpowiednich podło-

żach płynnych (3).

Postępy Fitoterapii

1/2007

Zeszyt 21

Z piśmiennictwa wynika, że zakażenia pałeczkami Helicobacter pylori spotykane są na

całym świecie i obejmują wszystkie grupy wiekowe ludności. Zakażenie dotyczy około 10%

dzieci i około 40-50% populacji ludzi dorosłych w krajach rozwiniętych, ale do 90% ludzi do-

rosłych w krajach rozwijających się (4, 5, 6). Helicobacter pylori może być przyczyną prze-

wlekłego zapalenia błony śluzowej żołądka, wrzodów żołądka i dwunastnicy, niektórych ty-

pów nowotworów żołądka, w tym gruczolakoraka (adenocarcinoma) (6, 7, 8, 9, 10, 11).

Patogenne działanie H. pylori wiąże się z wytwarzaniem proteazy i lipazy, które uszka-

dzają komórki nabłonka, proteazy rozkładającej glikoproteiny śluzu, enzymu proteolityczne-

go zwanego mucynazą, fosfolipazy, katalazy i cytotoksyny powodującej wakuolizację komó-

rek (6, 7, 12, 13, 14, 15). Produkuje też ureazę, która katalizuje hydrolizę mocznika z wytwo-

rzeniem amoniaku, dzięki któremu dochodzi do obniżenia pH środowiska i możliwości prze-

życia pałeczek w niesprzyjających warunkach (6, 7).

Wiadomo, że rezerwuarem pałeczek H. pylori jest człowiek, i że przenoszą się one

głównie drogą pokarmową. W 1989 roku Krejden i wsp. (16) wyhodowali te pałeczki z mate-

riału pobranego z jamy ustnej. Zapoczątkowało to dalsze badania pod kątem jamy ustnej jako

rezerwuaru dla Helicobacter pylori i możliwości nawrotu choroby wrzodowej żołądka lub

dwunastnicy, po wcześniejszym skutecznym leczeniu wymienionych schorzeń. Przeprowa-

dzone badania materiałów pobranych z jamy ustnej zaowocowały różnymi wynikami, od ne-

gatywnych, do stwierdzenia 100% obecności tych pałeczek (17, 18, 19, 20). Na różnice w

wynikach zapewnie miały wpływ użyte metody doświadczalne i oceniane przez badaczy po-

pulacje (wiek), region geograficzny (warunki sanitarne). Badacze nie są zgodni w kwestii, czy

Helicobacter pylori trwale kolonizuje jamę ustną. Jednak wszyscy uważają, że w przypadku

stwierdzenia obecności tych pałeczek w obrębie jamy ustnej należy dążyć do ich eliminacji,

zarówno z żołądka, jak i z jamy ustnej. Badania wykazały, że pałeczki H. pylori mogą być

obecne w jamie ustnej oraz w blaszce miażdżycowej zlokalizowanej w tętnicach szyjnych lu-

dzi (21, 22, 23). Rola tych drobnoustrojów w procesie tworzenia blaszki miażdżycowej i w

chorobach układu naczyniowo-sercowego jest obecnie badana (24, 25).

Do leczenia zakażeń wywołanych przez pałeczki H. pylori stosuje się różne antybiotyki,

w tym ampicylinę, amoksycylinę, makrolidy, tetracykliny, chinoloiny, metronidazol i tynida-

zol. Jednak coraz częściej szczepy tych pałeczek są oporne na stosowane antybiotyki. Wpły-

nęło to na poszukiwanie nowych substancji, w tym pochodzenia roślinnego, które byłyby

skuteczne w działaniu przeciw pałeczkom H. pylori . Prowadzone od wielu lat badania wyka-

zały, że szczepy H. pylori są wrażliwe na niektóre substancje i preparaty roślinne. Działanie

takie wykazują m.in. ekstrakty z czosnku (26, 27, 28), lukrecji (29, 30), imbiru (31), kminku

(31), tymianku (32), cynamonu (33) oraz olejki eteryczne, takie jak czosnkowy (26, 27, 28),

tymiankowy (32), imbirowy (34), miętowy (34, 35), jałowcowy (35), eukaliptusowy (35), ba-

zyliowy (35), szałwiowy (36) i rumiankowy (37).

Ponieważ pałeczki Helicobacter pylori występują w jamie ustnej (ślina, kieszonki przy-

zębne), która prawdopodobnie jest rezerwuarem tych drobnoustrojów w organizmie, skąd

mogą one rozprzestrzeniać się do różnych miejsc, postanowiliśmy ocenić ich wrażliwość na

Postępy Fitoterapii

1/2007

Zeszyt 21

preparaty stosowane w obrębie jamy ustnej w różnych jej schorzeniach. Do badań użyliśmy 2

preparaty Dentosept i Dentosept A. Dentosept zawiera wyciągi płynne z kory dębu, koszycz-

ków rumianku, liści szałwii, ziela tymianku, arniki, mięty, kłącza tataraku oraz etanol (60-

70% v/v). Natomiast Dentosept A składa się z Dentoseptu, do którego dodano benzokainę i

tetraboran sodu. Oba preparaty działają przeciwzapalnie i ściągająco. Zawartość olejków ete-

rycznych zapewnia działanie antyseptyczne. Znajdująca się w składzie Dentoseptu A benzo-

kaina wywiera działanie miejscowo znieczulające, a dodatek substancji zagęszczających

wpływa korzystnie, ponieważ przedłuża miejscowe działanie preparatu. Dentosept stosowany

jest do płukania jamy ustnej i gardła, a Dentosept A do pędzlowania błony śluzowej jamy ust-

nej. Oba preparaty stosowane są w zapaleniu dziąseł i błony śluzowej jamy ustnej, w zapale-

niu przyzębia, w przewlekłym zapaleniu języka, odleżynach w jamie ustnej (związanych z

użytkowaniem protez zębowych) i w krwawieniu z dziąseł.

Celem badań była ocena wrażliwości Gram-ujemnych pałeczek z gatunku Helicobacter

pylori na Dentosept i Dentosept A (wytwarzane przez Phytopharm w Klęce).

Materiał i metody

Pałeczki Helicobacter pylori zostały wyizolowane z materiałów pobranych z kieszonek

przyzębnych (7 szczepów) oraz z blaszki miażdżycowej tętnic szyjnych (5 szczepów). Mate-

riały (po aseptycznym pobraniu) posiewano na agar Columbia z dodatkiem 5% krwi baraniej i

na selektywne podłoże Pylori agar (bioMerieux) i hodowano w warunkach mikroaerofilnych

w anaerostacie zawierającym Campy Pak (Beckton Dickinson), w 37ºC przez 4-5 dni. Szcze-

py Helicobacter pylori były klasyfikowane na podstawie typowej morfologii komórek (prepa-

rat barwiony metodą Grama) i testów biochemicznych, w tym testu API CAMPY (bioMe-

rieux), wytwarzania oksydazy, katalazy, ureazy i innych cech (test Rapidec pylori, test API

ZYM, bioMerieux).

Oznaczenie wrażliwości 12 wyizolowanych szczepów H. pylori i szczepów wzorco-

wych Campylobacter jejuni ATCC 29428 i Enterococcus faecalis ATCC 29212 przeprowa-

dzono metodą seryjnych rozcieńczeń Dentoseptu i Dentoseptu A w agarze Brucella z dodat-

kiem 5% odwłóknionej krwi baraniej. Badania objęły następujące rozcieńczenia preparatów:

20, 10, 5, 2,5, 1,2 i 0,6 mg w 1 ml. Do każdej serii badań wykonywano kontrolę wzrostu

szczepów na agarze Brucella z dodatkiem 5% krwi baraniej, nie zawierającym ocenianych

preparatów. Inoculum zawierało 10 5 CFU/ na kroplę i było nanoszone na powierzchnię podło-

ży aparatem Steersa. Inkubację posiewów i podłoży kontrolnych prowadzono w warunkach

mikroaerofilnych (Campy Pak) w temp. 37ºC przez 48 godz. Za MIC uznawano takie naj-

mniejsze rozcieńczenie preparatu, które całkowicie hamowało wzrost badanych bakterii.

Wyniki

W tabeli 1 zebrano wyniki badań wrażliwości pałeczek Helicobacter pylori na Dentosept i

Dentosept A. Dentosept wykazał skuteczne działanie wobec większości badanych szczepów

Postępy Fitoterapii

1/2007

Zeszyt 21

H. pylori . Spośród 12 szczepów ocenianych pałeczek, 1 szczep był wrażliwy na niskie stęże-

nie wynoszące 1,2 mg/ml, 1 na 5,0 mg/ml, a 2 szczepy na stężenie w wysokości 10 mg/ml.

Kolejne 4 (33%) szczepy były wrażliwe na 20 mg/ml Dentoseptu. Jednak wzrost prawie 1/3

szczepów (4 szczepy, 33%) nie był hamowany w zakresie badanych stężeń (MIC > 20

mg/ml).

Drugi oceniany preparat (Dentosept A) w niskich stężeniach był aktywny wobec 2

szczepów (zakres stężeń 1,2-2,5 mg/ml). Jeden szczep wymagał do zahamowania wzrostu

preparatu w stężeniu wynoszącym 5 mg/ml. Kolejne 3 oceniane szczepy były wrażliwe na 10

mg/ml, a 4 na 20 mg/ml badanego preparatu. Wzrost pozostałych 2 (17%) szczepów nie był

hamowany w zakresie testowanych stężeń (MIC > 20 mg/ml).

Z badań wynika, że Dentosept A był bardziej skuteczny od Dentoseptu. W zakresie stę-

żeń od 1,2 do 20 mg/ml Dentosept A działał aktywnie wobec 10 (83%) szczepów H. pylori , a

Dentosept wobec 8 (67%) ocenianych szczepów.

Tabela 1. Wrażliwość na Dentosept i Dentosept A 12 szczepów Helicobacter pylori

Drobnoustroje

Najmniejsze stężenie hamujące (MIC w mg/ml)

Dentosept Dentosept A

>20,0 20,0 10,0 5,0 2,5 1,2 0,6 >20,0 20,0 10,0 5,0 2,5 1,2 0,6

Helicobacter

pylori 1

Helicobacter

pylori 5

Helicobacter

pylori 6

Helicobacter

pylori 8

Helicobacter

pylori 9

Helicobacter

pylori 12

Helicobacter

pylori 15

Helicobacter

pylori 21

Helicobacter

pylori 30

Helicobacter

pylori 31

Helicobacter

pylori 32

Helicobacter

pylori 40

Ogółem

4 4 2 1

2 4 3 1 1 1

Dyskusja

Do leczenia zakażeń wywołanych przez Helicobacter pylori nadaje się niewiele anty-

biotyków. Pałeczki te coraz częściej wykazują oporność na wcześniej skuteczne leki przeciw-

drobnoustrojowe tj. metronidazol i antybiotyki betalaktamowe. Preparaty roślinne, a szczegól-

Postępy Fitoterapii

1/2007

Zeszyt 21

nie zawierające olejki eteryczne, często działają skutecznie wobec antybiotykoopornych

szczepów H. pylori . Doświadczenia przeprowadzone przez różnych autorów wskazują, że

olejki eteryczne wywierają działanie bakteriostatyczne lub bakteriobójcze na wiele drobno-

ustrojów (28, 35-39). Zawarte w badanych przez nas preparatach Dentosept i Dentosept A

wyciągi roślinne zawierają substancje o działaniu przeciwdrobnoustrojowym. Dotyczy to

szczególnie olejków eterycznych, takich jak rumiankowy, szałwiowy, tymiankowy i miętowy.

Aktywność przeciwbakteryjną wymienionych olejków potwierdzają doświadczenia przepro-

wadzone przez Ohno i wsp. (35), którzy wykazali m.in. aktywność olejku miętowego wobec

pałeczek H. pylori , w stężeniach wynoszących do 1000 μg/ml. Natomiast Wessler i wsp. (33),

którzy oceniali skuteczność działania 15 różnych olejków eterycznych udowodnili, że najbar-

dziej aktywne były olejki: rumiankowy, pomarańczowy i imbirowy. Inni autorzy (34) wykaza-

li wysoką wrażliwość szczepów H. pylori na ekstrakt cynamonowy. Działanie ekstraktów wo-

bec tych pałeczek było skuteczniejsze od działania ocenianych równocześnie antybiotyków,

takich jak ampicylina, tetracyklina, erytromycyna, kwas nalidyksowy, kotrimoksazol i eks-

trakt tymiankowy. Autorzy zwrócili też uwagę na zmniejszenie lub całkowite zahamowanie

wytwarzania ureazy przez ekstrakt cynamonowy (34). Wcześniejsze badania Tabaka i wsp.

(32) wykazały nie tylko zahamowanie wzrostu H. pylori przez wyciąg z tymianku, ale także

hamowanie wytwarzania ureazy. Jest to zjawisko korzystne, ponieważ ten enzym jest związa-

ny z patogenezą tych drobnoustrojów.

Niektórzy autorzy oceniali wpływ środków roślinnych na szczepy bakterii wrażliwych i

opornych na antybiotyki. Wyniki badań są zachęcające. Fukai i wsp. (29) wykazali, że flawo-

noidy wyodrębnione z ekstraktu z lukrecji działają na szczepy H. pylori , zarówno wrażliwe

jak i oporne na amoksycylinę i klarytromycynę, czyli antybiotyki często stosowane w lecze-

niu choroby wrzodowej żołądka i dwunastnicy. Imai i wsp. (40) udowodnili, że olejek z mięty

pieprzowej ( Mentha piperita L.) i z mięty zielonej ( Mentha spicata L.) charakteryzowały się

aktywnością przeciw pałeczkom H. pylori , w tym szczepom zarówno antybiotykowrażliwym,

jak i antybiotykoopornym.

Ohno i wsp. (35) badali wpływ 13 różnych olejków eterycznych na szczepy H. pylori ,

wśród których były m.in. olejki: miętowy, eukaliptusowy, rozmarynowy, jałowcowy, lawen-

dowy, z drzewa herbacianego i bazyliowy. Izolaty kliniczne Helicobacter pylori były oporne

na jeden lub więcej antybiotyków, w tym na klarytromycynę i metronidazol. Wszystkie oce-

niane przez Ohno i wsp. (35) olejki w stężeniu 0,1% (v/v) całkowicie hamowały wzrost testo-

wanych szczepów. Ponadto w badaniach in vivo , wymienieni autorzy wykazali też pewne ko-

rzystne działanie na myszy zakażone pałeczką H. pylori . Najskuteczniejsze działanie zaobser-

wowano w przypadku olejku lemongrasowego, który doprowadził do znacznego obniżenia

liczby H. pylori w żołądku u 10 myszy, a u 1 z poddanych doświadczeniu myszy objawy cho-

roby cofnęły się całkowicie i doszło do wyleczenia. Autorzy sugerują, że olejek ten może być

użyty w skojarzeniu z antybiotykami, na które pałeczki H. pylori są najbardziej wrażliwe, co

zwiększyłoby skuteczność prowadzonej terapii.

Postępy Fitoterapii

1/2007

Zeszyt 21

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: