Wykrywanie cukrowców oraz kwasów nukleinowych (DNA)
w ekstrakcie drożdżowym
Kwasy rybonukleinowe i dezoksyrybonukleinowych można wykrywać i odróżniać na podstawie analizy składnika cukrowego, zasady azotowej oraz kwasu azotofosforowego.
Celem ćwiczenia jest poznanie reakcji barwnych umożliwiających wykrywanie składników cukrowych. Wykazanie obecności tych składników następuje po ich uwolnieniu w wyniku częściowej lub całkowitej hydrolizy. Całkowite uwolnienie zasad, cukrów i kwasu ortofosforowego z DNA i RNA następuje pod działaniem kwasów w podwyższonej temperaturze. Przez łagodną hydrolizę, przeprowadzoną zasadami lub enzymami, uzyskuje się większe fragmenty kwasów nukleinowych - nukleotydy i nukleozydy.
1. Otrzymywanie kwasów nukleinowych z drożdży
Drożdże są dogodnym źródłem kwasów nukleinowych. Kwasy te izoluje się w środowisku alkalicznym lub obojętnym, gdyż przy niższych wartościach pH następuje degradacja DNA. Do wytrącania kwasów nukleinowych z roztworów stosuje się etanol, a delipidację otrzymanego osadu prowadzi się przy pomocy eteru.
Wykonanie doświadczenia: Ze względu na czasochłonność wykonania ekstraktu kwasów nukleinowych każda sekcja otrzyma na zajęciach gotowy ekstrakt.
2. Hydroliza kwasów nukleinowych
Całkowitą hydrolizę kwasów nukleinowych do zasad azotowych, kwasu fosforowego i pentozy prowadzi się przy pomocy kwasu siarkowego w podwyższonej temperaturze.
Wykonanie doświadczenia
Do małej ilości kwasów nukleinowych dodać 5 ml 2n H2SO4, wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. Hydrolizat zobojętnić ługiem sodowym wobec papierka wskaźnikowego.
3. Wykrywanie cukrowców
W hydrolizacie kwasów nukleinowych wykazać można obecność pentoz przy pomocy reakcji Molischa na cukrowce i reakcji Biala na pentozy. Natomiast odróżnienie 2-dezoksyrybozy od rybozy może nastąpić za pomocą reakcji z dwufenyloaminą (reakcja Dischego). W środowisku kwaśnym 2-dezoksyryboza z dwufenyloaminą tworzy produkt kondensacji o barwie niebieskiej, a ryboza w tych warunkach nie reaguje.
3.1. Odróżnianie cukrowców od innych związków organicznych (próba Molischa).
Cukrowce pod wpływem stężonego kwasu siarkowego ulegają odwodnieniu przekształcając się w pochodne furfuralowe. Z pentoz powstaje furfural, natomiast z heksoz - hydroksymetylofurfural.
Wytworzone związki, posiadające grupę aldehydową połączone z heterocyklicznym układem furanowym, reagują z fenolami tworząc barwne produkty. W przypadku reakcji Molischa wynikiem kondensacji z naftolem jest produkt o fioletowej barwie.
Dodatni wynik z odczynnikiem Molischa dają również w większym stężeniu niektóre inne związki organiczne (aldehydy, kwasy, aceton).
Odmierzyć l ml próbki oraz dodać po 4 krople odczynnika Molischa, a następnie podwarstwić trzema mililitrami stężonego kwasu siarkowego (pipetą po ścianie skośnie ustawionej probówki).
Na granicy warstw w obecności cukrowca winien pojawić się fioletowy pierścień; często poniżej powstaje zielony krążek pochodzący od zanieczyszczeń α-naftolu.
3.2. Próba Biała na pentozy
Reakcja Biala pozwala na odróżnienie pentoz od heksoz. Tworzący się z pentoz pod wpływem ogrzewania z kwasem solnym furfural reaguje z orcyną (metylowa pochodna dwufenolu - rezorcyny), tworząc kompleks o zielonym zabarwieniu.
W tych samych warunkach dodatni wynik dają również dezoksypentozy, ale w słabym stopniu. Natomiast heksozy przekształcają się w hydroksymetylofurfural rozkładający się dalej. Związek ten tworzy z orcyną żółtobrązowy produkt.
Do probówki odmierzyć 5 ml odczynnika Biala. (Uwaga: pobierać pipetą z gruszką) i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut. Następnie do probówki wprowadzić l ml badanego roztworu. Ogrzewać przez kilka minut i zanotować wynik.
3.3 Wykrywanie DNA metodą dwufenyloaminową
Powszechnie stosowana metoda oznaczenia dezoksypentozy opiera się na reakcji z dwufenyloaminą. Reakcja ta polega na tworzeniu niebieskiego zabarwienia podczas ogrzewania DNA z dwufenyloaminą, kwasem octowym i siarkowym o temperaturze 100° przez kilka minut. Znacznie lepszą czułość reakcji otrzymuje się przez dodanie kwasu nadchlorowego oraz aldehydu octowego i rozwijanie koloru przez 17 godzin w 30°C, jednakże ze względów czasowych w ćwiczeniu wykorzystany jest pierwszy sposób prowadzenia reakcji. W reakcji bierze też udział wolna deoksyryboza.
Wykonanie ćwiczenie
Do probówki wprowadzić 1 ml badanej próbki oraz 4 ml odczynnika dwufenyloaminowego i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Zanotować wynik.
Sprawozdanie:
Omówić wyniki uzyskanych obserwacji odpowiadając jednocześnie na pytania:
Czy w badanej próbie występują cukrowce?
Czy w badanej próbie występują DNA i/lub RNA?
Jeżeli podczas wykonywania ćwiczenia natknięto się na rozbieżności w stosunku do informacji zawartych w instrukcji (np. czas inkubacji w łaźni wodnej), należy przedstawić własne obserwacje.
Na podstawie składu chemicznego DNA i RNA wskazać sposób odróżnienia tych dwóch kwasów nukleinowych (najlepiej wykonać tabelę porównawczą).
peroni69