Diagnostyka chorob genetycznych.pdf

Diagnostyka chorób genetycznych

Wykorzystanie:

1. wykrywanie chorób przed objawami

2. możliwość wykrywania nosicielstwa

3. diagnostyka prenatalna

4. rozróżnianie chorób objawiających się kliniczne tak samo

Pozyskiwanie materiału do badań (ilość zależy od techniki)z :

krew obwodowa (limfocyty), fibroblasty skóry, płyn owodniowy, komórki kosmówki, mocz, kał, nasienie, fragmenty włosów,

wycinki tkankowe, szpik kostny, materiały z biopsji

Izolacja DNA:

1. Metoda fenolowa daje preparaty DNA o wysokiej wydajności oraz dużą czystość; można stosować z krwi zamrożonej i

długo przechowywanej. Potrzeba dużo (10ml) krwi, stosuje się toksyczne odczynniki.

Przebieg izolacji:

a) Wstępna obróbka – izolacja z np. limfocytów, rozwarstwianie w fenolu oraz wirowanie z dodatkiem

substancji powodujących lizę erytrocytów

b) Liza erytrocytów

c) Trawienie białek (proteinaza K) (24-48h) w temp 37*C

d) Oczyszczanie preparatu (fenol + chloroform) – denaturacja białek i lipidów

e) Wytrącanie (precipitacja DNA)

f) Zawieszenie DNA w odpowiednim buforze – zabezpieczenie przed działaniem odpowiednich

endonukleaz

2. Metoda wysalania białek trwa 2dni, brak tox odczynników, ilość krwi – 5ml

a) Jw. pkt a i b

b) Trawienie białek przez 12-24h w temp 50*C

c) Oczyszczanie roztworem NaCl powodującym odsolenie białek

d) Reszta jw.

3. Metoda Grindberga ilość krwi 1ml, czas 6h, max przechowywanie krwi 1miesiąc.

Po przeprowadzeniu w/w procesów należy sprawdzić czystość i ilość DNA w preparacie przy pomocy badania

spektrofotometrycznego dla długości fali 260,260 i 280nm.

Ilość wyraża się w mg/ml i oblicza z wzoru

Z ´

260

gdzie: 50 – stały współczynnik R- rozcieńczenie

Czystość jest podawania w % i jest wyliczana ze stosunku wartości absorbancji dla wartości dla 260/280nm (1,8 dla 100% czystości

DNA) – wartości 1,8-1,6 uznaje się za poprawne.

Przy A 260 /A 230 < 2 w roztworze mukopolisacharydy; A 260 / A 280 > 2 białko.

Metoda PCR

Polega na powielaniu (amplifikacji) in vitro fragmentu genomowego DNA o wielkości od kilkudziesięciu do kilku tysięcy

par zasad.

Etapy PCR

1. Denaturacja dwuniciowego DNA w temp 93-95*C

2. Przyłączenie starterów (primerów) – temperatura zależy od sekwencji (50-60*C)

3. Polimeryzacja DNA w temp 72*C

W/w etapy powtarza się ok. 20-30 razy. Dzięki temu zwiększamy ile chcemy ilość DNA potrzebnego do dalszych badań.

Skład mieszaniny DNA matrycowy, primery (startery), wolne nukleotydy (dNTP: dATP, dGTP, dTTP, dCTP), Mg 2+ , polimeraza

Taq

Startery – syntetycznie uzyskane zawierają 20PZ, przyłączają się do 3`. Ograniczają zasięg syntezy.

Polimeraza Taq- wyizolowana z Thermus aquatiqus jest aktywa w temp 95*C, w przeciwieństwie do polimerazy z E. Coli .

Reakcja PCR przebiega w bloku grzejnym pozwalającym na szybkie zmiany temperatury – termocykler

Reakcja PCR „multiplex ” – w mieszaninie reakcyjnej znajduję się kilka par starterów dla różnych genów lub dla odmiennych

fragmentów tego samego genu.

Reakcja RT-PCR (technika izolacji RNA) proces PCR jest poprzedzony przepisaniem mRNA na komplementarne DNA (cDNA)

w reakcji odwrotnej transkrypcji w obecności startera, najczęściej uniwersalnego oligo dT lub oligonukleotydu swoistego dla

mRNA.

Stosuje się gdy nie wiadomo gdzie szukać.

Zastosowanie PCR:

Biologia molekularna

Medycyna (choroby genetyczne, zakaźne, diagnostyka prenatalna), medycyna sądowa (kryminalistyka, ustalanie ojcostwa)

Antropologia

ANALIZA PRODUKTÓW PCR

Enzymy restrykcyjne

Są izolowane z bakterii (np. Eco I – E. Coli restryktaza I), mają zdolność rozpoznania specyficznych miejsc w DNA- dając

fragmenty o określonych końcach.

Enzymy restrykcyjne :

· Miejsca rozpoznania i nacięcia są oddalone do 1000 par zasad

· Nacięcie występuje w miejscu rozpoznania

· Nacięcie oddalone od miejsca rozpoznania o 25 – 100 par zasad

Rodzaje generowanych końców:

· Nacięcie o 1 osi symetrii daje tępe końce

· Przecięcie wzdłuż różnych osi symetrii co daje tzw lepkie końce

Hybrydyzacja z sondą molekularną:

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: