Barwienia i API.doc

MIKROBIOLOGIA

ĆWICZENIE 5.

1. Barwienie złożone na kwasooporność wg metody Ziehl-Neelsena

Barwienie metodą Ziehl’a-Neelsen’a jest barwieniem złożonym i różnicującym. Większość bakterii ulega odbarwieniu pod wpływem roztworu kwasu i alkoholu. Wyjątek stanowią przedstawiciele rodzin Mycobacteriaceae, Nocardiaceae, Gordoniaceae i Tsukamurellaceae. Bakterie te charakteryzują się kwasoodpornością. Barwienie Ziehl-Neelsena ma duże znaczenie diagnostyczne, ponieważ do bakterii kwasoodpornych należy wiele organizmów chorobotwórczych w tym prątki i promieniowce.

Organizmy kwasooporne wytwarzają ścianę komórkową o dużej zawartości lipidów, wśród których występuje kwas mykolowy warunkujący cechę kwasooporności. Metoda Ziehl-Neelsena polega na wprowadzeniu do komórek roztworu fuksyny karbolowej (ciemnoczerwony barwnik zawierający 5% fenol). Preparat jest podgrzewany w celu ułatwienia penetracji barwnika, a następnie traktowany jest roztworem alkoholu etylowego zakwaszonego kwasem solnym. Roztwór ten z łatwością odbarwia większość bakterii, oprócz kwasoodpornych. W celu ułatwienia rozpoznania prątków, stosuje się dodatkowe dobarwianie barwnikiem kontrastowym – błękitem metylenowym. Czerwone prątki widoczne są wtedy na niebieskim tle preparatu. W modyfikacji Kinyoun’a stosuje się podwyższone stężenia fuksyny karbolowej i fenolu, dzięki czemu barwnik wnika do komórek bez konieczności podgrzewania preparatu.

Mechanizm barwienia na kwasooporność prawdopodobnie opiera się na względnej rozpuszczalności fuksyny karbolowej. Fuksyna jest bardziej rozpuszczalna w fenolu niż w wodzie, a fenol rozpuszcza się łatwiej w lipidach niż w kwaśnym roztworze alkoholu. W związku z tym fuksyna karbolowa ma większe powinowactwo do lipidów niż do zakwaszonego roztworu alkoholu i dlatego pozostaje związana w ścianie komórkowej, gdy preparat traktuje się kwaśnym alkoholem.

Materiały

fuksyna karbolowa Kinyoun’a

3% roztwór HCl w etanolu

błękit metylenu

tryskawka z wodą destylowaną

szkiełka podstawowe

eza

Kultury

Mycobacterium phlei

Escherichia coli

Procedura (Fig. 1)

1.      Przygotuj i utrwal preparaty obu badanych kultur

2.      Pokryj rozmazy fuksyną karbolową i pozostaw na 5 minut

3.      Ostrożnie wypłucz preparat wodą destylowaną z tryskawki; nie kieruj wody bezpośrednio na rozmaz

4.      Bez wysuszania preparatu, przepłucz go kwaśnym roztworem alkoholu w celu odbarwienia przez 1 minutę, lub do momentu aż przestanie uwalniać się czerwone zabarwienie z preparatu ustawionego pionowo

5.      Przepłucz preparat dokładnie wodą destylowaną

6.      Nanieś na preparat błękit metylenu na ok. 1 minutę

7.      Przepłucz preparat wodą destylowaną i osusz

8.      Przeprowadź obserwację wybarwionego preparatu; narysuj preparaty obserwowane pod mikroskopem

na utrwalony preparat nanieś fuksynę karboksylową i pozostaw na 5 minut

delikatnie wypłucz fuksynę z powierzchni rozmazu przy pomocy wody

przepłucz rozmaz zakwaszonym alkoholem i pozostaw na 1 minutę

delikatnie wypłucz rozmaz wodą

nanieś na rozmaz błękit metylenu i pozostaw na 1 minutę

delikatnie wypłucz preparat wodą

pozostaw preparat do wyschnięcia

Fig. 1. Barwienie na kwasooporność wg. Ziehl-Neelsena

2. Metody szybkiej identyfikacji bakterii – test API 20 E.

Sprawdzanie właściwości biochemicznych drobnoustrojów jest jednym z etapów diagnostyki mikrobiologicznej. Badania te przeprowadza się na specjalnych podłożach diagnostycznych lub podłożach wybiórczo-diagnostycznych. W badaniach tych wykorzystuje się najczęściej reakcje kataboliczne, tj. zdolność do rozkładu substratów za pomocą enzymów komórkowych. Produkty tych reakcji wykrywa się za pomocą wskaźników, odczynników lub specjalnych testów.

Identyfikacja bakterii w klinicznych laboratoriach mikrobiologicznych musi być przeprowadzona z dużą dokładnością i w szybki sposób. Dokładność analiz jest zapewniona poprzez używanie serii testów standaryzowanych.  Metody szybkiej identyfikacji dostarczają dużej liczny wyników wykonanych z jednej inokulacji. Przykładem takiej metody jest test API 20 E (bioMerieux Vitek, Inc.), który służy do identyfikacji Enterobacteriaceae i innych mało wymagających pałeczek Gram-ujemnych. Paski API 20 E składają się z 20 mikroprobówek zawierających odwodnione substraty. Integralną częścią testu API 20 E jest też test  na oksydazę. Substraty zostają uwodnione poprzez dodanie zawiesiny bakterii. Uwodnione substraty stanowią również podłoża do hodowli bakterii. Procesy metaboliczne zachodzące podczas inkubacji powodują zmiany koloru, które są albo spontaniczne, albo wywołane przez dodanie odczynników. Lista testów znajdujących się na paskach API 20 E przedstawiona jest w Tabeli Odczytów (Tabela 1). Po odczytaniu reakcji według Tabeli Odczytów, identyfikuje się przez porównanie z Książką Kodów lub stosując program komputerowy. Użycie systemu API 20 E nie wymaga specjalnych metod hodowli drobnoustrojów. Testy przeprowadza się na organizmach wyizolowanych bezpośrednio z badanych prób.

Materiały

paski API 20 E

komory inkubacyjne

odczynniki API (API NaCl 0,85% Medium, API Suspension Medium, API 20 E reagent kit, odczynnik Zn, oksydaza, olej mineralny)

pipety

eza

probówki

Kultury

Escherichia coli

Procedura (Fig. 2)

1.      W celu przygotowania komory inkubacyjnej (pokrywki i podstawki) należy na podstawkę nanieść ok. 5 ml  wody destylowanej w kształcie mozaiki, w celu zapewnienia odpowiedniej wilgotności podczas inkubacji

2.      Wyjąć pasek z opakowania i umieścić w komorze inkubacyjnej

3.      Przygotować jednorodną zawiesinę bakterii poprzez pobranie pipetą pojedynczej kolonii i dodanie jej do probówki zawierającej 5 ml soli fizjologicznej

4.      Przy pomocy tej samej pipety napełnić zawiesiną bakteryjną probówki na pasku (unikając tworzenia się pęcherzyków przy podstawie probówki, przechylając nieco pasek i umieszczając końcówkę pipety naprzeciw zagłębienia)dla testów CIT, VP i GEL napełnić zarówno probówkę jak i wgłębienie mikroprobówkidla innych testów napełnić jedynie probówkę (bez wgłębień)

5.      dla testów ADH, LCD, ODC, H2S i URE wytworzyć warunki beztlenowe poprzez naniesienie oleju mineralnego

6.      Zamknąć komorę inkubacyjną

7.      Inkubować w 36oC przez 18-24 h

8.      Po inkubacji odczytać pasek korzystając z Tabeli Odczytów

9.      Jeśli 3 lub więcej testów (test GLU + lub -) jest pozytywnych zanotować wyniki wszystkich reakcji spontanicznych na karcie wyników a następnie odczytać testy wymagające dodania odczynników

10.  test TDA: dodać 1 kroplę odczynnika TDA (chlorek żelaza). Czerwono-brązowy kolor wskazuje na reakcję pozytywną co należy wpisać do karty wyników

11.  test VP: dodać po 1 kropli z każdego odczynnika VP1 (α-naftol) i VP2 (KOH). Odczekać przynajmniej 10 min; różowy lub czerwony kolor wskazuje na reakcję pozytywną; jeśli po 10 min pojawi się blado różowy kolor, reakcję należy uznać za negatywną

12.  test IND: dodać 1 kroplę odczynnika JAMES; różowy kolor powstający w całej probówce wskazuje na reakcję pozytywną

UWAGA: Test Indol należy wykonać na końcu, ponieważ w trakcie jego wykonania dochodzi do wytwarzania produktów gazowych, które wpływają na interpretację innych wyników na pasku. Plastikowa pokrywka inkubacyjna nie powinna być podnoszona po dodaniu odczynnika.

1.      Wykonać test na oksydazę (OX); kroplę odczynnika (oksydazy) zakroplić bezpośrednio na dobrze wyizolowaną kolonię w szalce Petriego; w przypadku pozytywnej reakcji nastąpi zmiana koloru na różowy w ciągu 1 minuty, następnie na niebieski i czarny; w przypadku reakcji negatywnej nie nastąpi zmiana zabarwienia kolonii

2.      Interpretację wyników otrzymuje się z profilu numerycznego; na  karcie wyników testy podzielone są na grupy po 3, każdy odpowiednio o wartości 1, 2 i 4;  przez dodanie do siebie wartości odpowiadających pozytywnym reakcjom w obrębie każdej grupy otrzymuje się 7 cyfrowy profil numeryczny dla 20 testów występujących na pasku API 20 E; reakcja oksydazy stanowi 21 test i ma wartość 4, jeśli jest pozytywna

3.      Identyfikację bakterii uzyskuje się używając bazy danych z Książki Kodowej, poprzez odszukanie właściwego profilu numerycznego, lub przy pomocy oprogramowania komputerowego apiwebTM

W niektórych przypadkach 7 cyfrowy profil nie jest wystarczająco charakterystyczny i należy przeprowadzić następujące testy uzupełniające:

12. Redukcja azotanów do azotynów (NO2) i gazowego azotu (N2): dodać po 1 kropli z każdego odczynnika NIT 1 i NIT 2 do probówki GLU. Odczekać 2-5 minut. Czerwony kolor wskazuje na reakcję pozytywną (NO2); reakcja negatywna (żółty) może być spowodowana redukcją do azotu (co czasami jest uwidaczniane przez pęcherzyki gazu); w celu weryfikacji należy dodać 2-3 mg odczynnika Zn do probówki GLU; po 5 min jeśli probówka pozostaje żółta wskazuje to na reakcję pozytywną (N2), co należy zanotować w karcie wyników; jeżeli pojawia się kolor pomarańczowo-czerwony jest to wynik negatywny: azotany nadal występujące w probówce zostały zredukowane przez cynk 

UWAGA: Dla takich samych powodów jak test na indol, test redukcji azotanów musi być przeprowadzony jako ostatni.

przygotuj zawiesinę

dobrze wyizolowanej kolonii

zaszczep bakterie w zawiesinie do probówek na pasku API.

W przypadku testów CIT, VP i GEL napełnij mikroprobówki

oraz ich wgłębienia

odwodnione

substraty

wgłębienie

mikroprobówka

nanieś olej mineralny do wgłębień probowek dla testów ADH, LCD, ODC, H2S i URE

umieść pasek w komorze inkubacyjnej

Fig. 2. Przygotowanie pasków testu API 20 E

Page 5 of 8