ImmunologiaKrwinkiCzerwonej.pdf

(1072 KB) Pobierz
QPrint
Rozdziaþ
IMMUNOLOGIA TRANSFUZJOLOGICZNA KRWINEK CZERWONYCH
1. ZAKRES BADAİ U KRWIODAWCìW
1. OkreĻlanie grup krwi ukþadu ABO przy uŇyciu dwch zestaww odczynnikw
monoklonalnych anty-A i anty-B pochodzĢcych z rŇnych klonw oraz krwinek
wzorcowych grupy O, A 1 i B.
2. OkreĻlanie antygenu D z ukþadu Rh za pomocĢ 2 odczynnikw monoklonalnych anty-D,
pochodzĢcych z rŇnych klonw i umoŇliwiajĢcych wykrycie sþabej odmiany antygenu D
(D u ) i jego kategorii.
3. OkreĻlanie antygenu K z ukþadu Kell u wszystkich wielokrotnych dawcw i fenotypu Rh u
wszystkich wielokotnych dawcw grupy O oraz w miarħ moŇliwoĻci u dawcw innych grup
krwi.
4. OkreĻlanie antygenu k u dawcw K dodatnich.
5. OkreĻlanie klinicznie waŇnych antygenw innych ukþadw grupowych u wielokrotnych
dawcw, szczeglnie grupy O.
6. Wykrywanie i identyfikacja przeciwciaþ odpornoĻciowych:
a) u wszystkich dawcw pierwszorazowych,
b) u wszystkich dawcw wielokrotnych, ktrzy byli leczeni krwiĢ w okresie roku
poprzedzajĢcego oddanie krwi oraz u kobiet z ciĢŇĢ w wywiadzie.
UWAGI
A. W badaniach grup krwi ukþadu ABO dwch prbek krwi dawcy przy zastosowaniu 2
zestaww odczynnikw monoklonalnych i posþugiwaniu siħ krwinkami z prbek macierzystych
(nie przemywanych), dopuszcza siħ zbadanie jednej prbki jednym zestawem odczynnikw a
drugiej prbki drugim zestawem pod warunkiem, Ňe w obu prbkach oznacza siħ przeciwciaþa
anty-A i anty-B.
B. W oznaczeniach grupy krwi ukþadu ABO wykonywanych w systemach
zautomatyzowanych zapewniajĢcych jednoznacznĢ identyfikacjħ badanej prbki, dopuszcza siħ
stosowanie jednego zestawu odczynnikw monoklonalnych anty-A i anty-B pod warunkiem, Ňe
w kaŇdej prbce krwi dawcy oznacza siħ przeciwciaþa anty-A i anty-B. Szczegþowe zasady
opisano w rozdziale 5.15. automaty i pþautomaty stosowane w badaniach serologicznych.
C. Peþne badanie grup krwi ukþadu ABO i antygenu D z ukþadu Rh, jak rwnieŇ wszystkich
innych antygenw wykonuje siħ dwukrotnie z prbek krwi pobranych w rŇnym czasie.
D. Dla systemw automatycznych dopuszcza siħ stosowanie do oznaczania alloaglutynin
zestawu krwinek A 1 i B z pominiħciem krwinek grupy O.
E. Wpisywanie grup krwi ABO i Rh w systemie komputerowym lub w kartotece dawcy musi
opieraę siħ na wynikach badaı dwch prbek krwi: prbki pobranej w laboratorium i prbki
pobranej bezpoĻrednio po oddaniu krwi w dziale pobierania.
F. Dyrektor centrum w porozumieniu z kierownikiem dziaþu immunologii
transfuzjologicznej ustala, w ktrych terenowych oddziaþach moŇliwe jest wykonywanie badaı
o poszerzonym zakresie, wymienionych w punktach 3-5; pozostaþe oddziaþy terenowe, nie
posiadajĢce odpowiednich warunkw, mogĢ byę z tych obowiĢzkw zwolnione.
G. SwoistoĻę przeciwciaþ odpornoĻciowych, wykrytych w terenowych pracowniach
serologicznych, jest ustalana lub potwierdzana w centrum w pracowni badaı dawcw.
H. Identyfikacja przeciwciaþ typu zimnego dotyczy tylko przypadkw, w ktrych sĢ one
wykrywane podczas okreĻlania grup krwi ukþadu ABO i reagujĢ w poszerzonej amplitudzie
cieplnej (30 do 37 o C).
Wszystkie rutynowe metody rħczne moŇna zastħpowaę mikrometodami kolumnowymi i
automatycznymi, wedþug zasad opisanych w rozdziale 5.15. automaty i pþautomaty stosowane
w badaniach serologicznych.
2. BADANIA KONSULTACYJNE
Badania takie sĢ wykonywane w pracowni konsultacyjnej centrum we wszystkich
przypadkach, w ktrych terenowe pracownie serologiczne (szpitalne i pozaszpitalne) natrafiajĢ
na trudnoĻci. Do pracowni naleŇy przekazaę badanĢ i ĻwieŇo pobranĢ prbkħ krwi wraz z
dokumentacjĢ dotychczas przeprowadzonych badaı (Wzr 1) oraz dane kliniczne (wiek,
rozpoznanie, informacje dotyczĢce leczenia krwiĢ i przebytych ciĢŇ). W pracowni prbkħ krwi
opatruje siħ kolejnym numerem odnotowanym w ksiĢŇce badaı. W pilnych przypadkach naleŇy
odnotowaę godzinħ przyjħcia prbki i godzinħ wydania wyniku. Przy nazwisku chorego naleŇy
zamieĻcię dane kliniczne zawarte w skierowaniu do badania. Czytelne protokoþy badaı
powinny byę zakoıczone sformuþowaniem wyniku zrozumiaþym dla odbiorcy, w brzmieniu
identycznym z wydanym wynikiem. W ksiĢŇce badaı i na wydanym wyniku powinien byę
umieszczony podpis osoby wykonujĢcej badania i osoby nadzorujĢcej (kierownik pracowni
albo osoba upowaŇniona). Dopuszcza siħ stosowanie formularzy zawierajĢcych odpowiednie
rubryki dotyczĢce protokoþw w zakresie najczħĻciej wykonywanych badaı z pozostawieniem
miejsca na protokoþy badaı, ktrych nie moŇna przewidzieę. Dane dotyczĢce chorych i
wynikw badaı naleŇy wprowadzaę do komputera pod warunkiem posiadania odpowiedniego
programu. W przypadku braku programu naleŇy prowadzię dokumentacjħ w skorowidzu w
porzĢdku alfabetycznym.
W godzinach pracy pozaregulaminowej technicy lub pracownicy peþniĢcy dyŇury powinni
prowadzię w odrħbnej ksiĢŇce (ksiĢŇka raportw) rejestr wykonanych czynnoĻci wraz z
zaznaczeniem godziny przyjħcia prbki i godziny wydania wyniku.. Informacje te powinny byę
co dzieı rano sprawdzane przez kierownika pracowni lub osobħ upowaŇnionĢ.
Zakres badaı:
1. Ustalanie grupy krwi ukþadu ABO.
2. Diagnostyka antygenu D z ukþadu Rh, obejmujĢca jego sþabe odmiany i kategorie.
3. Identyfikacja nieregularnych przeciwciaþ.
4. Diagnostyka niedokrwistoĻci autoimmunohemolitycznych (NAIH).
5. Dobieranie krwi dla chorych w przypadkach obecnoĻci auto- i alloprzeciwciaþ oraz przy
kaŇdej zgþoszonej niezgodnoĻci w prbie krzyŇowej.
6. Serologiczna analiza powikþaı poprzetoczeniowych
7. OkreĻlanie fenotypu Rh, antygenu K lub innych antygenw u osb uodpornionych oraz w
celu zapobiegania alloimmunizacji u chorych wymagajĢcych dþugotrwaþego leczenia krwiĢ
(np. w NAIH).
8. Diagnostyka konfliktu serologicznego pomiħdzy matkĢ a pþodem.
9. Wykonywanie badaı rodzinnych w przypadkach stwierdzenia rzadko wystħpujĢcych
fenotypw i alloprzeciwciaþ skierowanych do antygenw powszechnych.
10. Badania biorcw i dawcw allogenicznych przeszczepw, w szczeglnoĻci komrek
macierzystych ukþadu krwiotwrczego.
3. PODSTAWOWE WYPOSAņENIE W APARATURĦ, SPRZĦT
LABORATORYJNY I ODCZYNNIKI
3.1. Aparatura
1. Lodwka o temperaturze 2 Î 6 o C z zamraŇalnikiem.
2. ZamraŇarka o temperaturze od -20 o C do -80 o C do przechowywania surowic
diagnostycznych i pochodzĢcych od chorych, u ktrych wykryto alloprzeciwciaþa oraz
zapasw krwinek wzorcowych i innych z fenotypami o niskiej czħstoĻci wystħpowania.
3. Cieplarka.
4. Powietrzny blok grzewczy z regulacjĢ temperatury.
5. ýaŅnia wodna z regulacjĢ temperatury do 100 o C.
6. Wirwka laboratoryjna z przyspieszeniem 3850 x g (5000 obr / min) i regulacjĢ czasu
wirowania (Ryc.1).
7. Wirwka hematokrytowa.
8. Mikroskop Ļwietlny.
9. Aparatura do testw mikrokolumnowych.
10. Automaty do badaı grup krwi.
UWAGA
KaŇda lodwka i zamraŇarka powinna byę wyposaŇona w dwa niezaleŇne mierniki
temperatury. ObowiĢzuje trzykrotna w ciĢgu dnia kontrola temperatury i prowadzenie jej
dokumentacji lub podþĢczenie do centralnego monitoringu temperatury.
3.2. SPRZĦT LABORATORYJNY
1. Probwki wyþĢcznie do jednorazowego uŇytku
a/ do pobierania krwi szklane o wymiarach ok. 100 mm x 15 mm okrĢgþodenne lub z dnem
stoŇkowym albo specjalne probwki plastykowe,
b/ do wykonywania badaı szklane lub plastykowe o wymiarach ok. 70 mm x 10 mm.
2. Szkieþka podstawowe
3. Pþyty jednorazowe ze sztucznego tworzywa z pþaskimi wgþħbieniami lub szklane.
4. Pipety pasteurowskie - w miarħ moŇliwoĻci jednorazowe.
5. Pipety automatyczne z jednorazowymi koıcwkami.
6. Zlewki lub pojemniki z tworzywa sztucznego.
7. Pojemniki na szkþo i zuŇyty sprzħt jednorazowy.
8. Kasety plastykowe wysþane gĢbkĢ ze sztucznego tworzywa do umieszczania szkieþek lub
pþyt.
9. Statywy do probwek dwu- lub wielorzħdowe (metalowe lub ze sztucznego tworzywa).
10. Nalepki samoprzylepne.
11. Pisaki wodoodporne.
12. Kolby miarowe o pojemnoĻci 1-2 l.
3.3. ODCZYNNIKI
Przed uŇyciem odczynnikw naleŇy codziennie sprawdzaę ich wyglĢd zewnħtrzny.
Zmħtnienie i widoczne strĢty dyskwalifikujĢ dany odczynnik.
3.3.1. 0,15 mol/l roztwr NaCl * o pH 6,6- 7,6
NaCl rozpuĻcię w wodzie destylowanej.
JeŇeli pH roztworu nie mieĻci siħ w przedziale 6,6-7,6 doprowadzię roztwr do wymaganego
pH za pomocĢ buforu fosforanowego.
UWAGA
JeĻli uŇywa siħ roztwr bez dodatku buforu fosforanowego, kontrolħ pH wykonuje siħ
codziennie.
StosujĢc roztwr buforowany naleŇy kontrolowaę kaŇdĢ nowĢ seriħ odczynnika przed
udostħpnieniem jej do badaı.
3.3.2. Roztwr NaCl o niskiej sile jonowej (0,03 mol/l) - LISS (low ionic strength
solution)
Odczynniki: 0,17 mol/l roztwr NaCl - 180 ml
0,15 mol/l bufor fosforanowy o pH 6,7 - 20 ml
0,3 mol/l glicynian sodu o pH 6,7 - 800 ml
Przygotowanie roztworu glicynianu sodu
1. 22,5 g glikokolu rozpuĻcię w 800 ml wody destylowanej.
2. Za pomocĢ 1 mol/l NaOH dodawanego kroplami doprowadzię do pH 6,7.
3. Uzupeþnię wodĢ destylowanĢ do objħtoĻci 1000 ml.
Po przygotowaniu roztworu LISS naleŇy sprawdzię pH, ktre winno siħ mieĻcię w granicach
6,5 - 7,0. Jego optymalnĢ wartoĻciĢ jest 6,7.
* OkreĻlenie w tekĻcie "roztwr NaCl" oznacza 0,15 mol/l wodny roztwr NaCl
UWAGI
A. Kontrola jakoĻci roztworu LISS polega na wykonaniu testu antyglobulinowego z
krwinkami Rh+ i Rh-, zawieszonymi w tym roztworze i uczulonymi standardem anty-D wg
przepisu na str.
B. SporzĢdzony roztwr LISS sterylizuje siħ w temp. 105 o C przy 0,2 atm w ciĢgu 30 min. i
przechowuje w porcjach (50-100 ml) w stanie zamroŇenia lub w temp. 4 o C.
3.3.3. Roztwr papainy aktywowanej chlorowodorkiem cysteiny
Skþadniki:
a/ roztwr papainy:
10 g papainy rozpuĻcię w 250 ml 0,07 mol buforu fosforanowego o pH 6,2;
silnie wstrzĢsnĢę i pozostawię do nastħpnego dnia w lodwce w temp. 4 o C.
b/ bufor fosforanowy 0,07 mol, pH 6,2:
KH 2 PO 4 - 9,078 g/l wody dest. - 8 objħtoĻci
Na 2 HPO 4 - 11,188 g/l wody dest. - 2 objħtoĻci
c/ roztwr chlorowodorku cysteiny
4,85 g chlorowodorku L-cysteiny rozpuĻcię w 25 ml buforu fosforanowego o podanym wyŇej
skþadzie.
Przygotowanie odczynnika papainowego:
1. Roztwr papainy odwirowaę i przelaę do kolby o obj. 1 l.
2. Dodaę przygotowany roztwr chlorowodorku L-cysteiny.
3. Uzupeþnię buforem fosforanowym do objħtoĻci 1 l.
4. Inkubowaę przez 1 godzinħ w þaŅni wodnej lub w cieplarce w temp. 37 0 C.
5. PrzesĢczyę przez bibuþħ filtracyjnĢ.
6. Skontrolowaę aktywnoĻę roztworu.
7. Porcjowaę w maþych objħtoĻciach ( 1 - 2ml) w ampuþkach lub fiolkach szczelnie
zamkniħtych.
8. Przechowywaę w zamroŇeniu.
UWAGI
A. Odczynnik papainowy moŇe byę rwnieŇ przechowywany w temp. 4 o C w ciĢgu 3
miesiħcy.
B. Odczynnik wyjħty z lodwki lub rozmroŇony moŇe sþuŇyę do badaı tylko w ciĢgu kilku
godzin.
3.3.4. Roztwr papainy aktywowanej chlorowodorkiem cysteiny z dodatkiem cystyny
Odczynnik ten jest mniej wraŇliwy na wahania temperatury.
Skþad odczynnika:
100 ml buforu fosforanowego 0,07 mol/l o pH 6,7
0,48 g chlorowodorku L-cysteiny
1 g L-cystyny
1 g papainy
Przygotowanie odczynnika:
a) 1 g papainy rozpuĻcię w 25 ml buforu i pozostawię przez 30 min. w temp. pokojowej,
b) 1 g L-cystyny dodaę do 72,5 ml buforu i pozostawię przez 30 min. w temp. pokojowej.
Obydwa roztwory (a i b) wirowaę przez 10 min. przy 1366 x g,
c) 0,48 g chlorowodorku cysteiny rozpuĻcię w 2,5 ml buforu,
d) pþyn z nad osadu papainy zmieszaę z roztworem chlorowodorku cysteiny (a+c) i pozostawię
przez 5 min,
e) pþyn znad osadu L-cystyny zmieszaę z roztworem papainy i chlorowodorkiem cysteiny
(b+d),
f) otrzymanĢ mieszaninħ wstawię do þaŅni wodnej o temp. 37 o C na 1 h i wirowaę przez 10 min.
przy 1366 x g.
Przygotowany roztwr znad osadu, naleŇy rozlaę do maþych pojemnikw i zamrozię.
UWAGI
A Odczynnik moŇna przechowywaę w stanie zamroŇenia przez kilka miesiħcy
B. Odczynnik nie traci aktywnoĻci po pozostawieniu go przez 8 godzin w temp. pokojowej
w czasie pracy i po ponownym zamroŇeniu.
Kontrola aktywnoĻci odczynnikw papainowych
1. Na 2 szkieþkach podstawowych umieĻcię z jednej strony kroplħ surowicy anty-D (ludzkiej),
a z drugiej kroplħ surowicy grupy AB.
2. Do wszystkich kropli dodaę po jednej kropli odczynnika papainowego.
3. Do dwch kropli na jednym szkieþku dodaę po kropli 10% zawiesiny krwinek Rh+ w
roztworze NaCl, a na drugim po kropli 10% zawiesiny krwinek Rh-.
4. Po wymieszaniu zawartoĻci skþadnikw umieĻcię szkieþka w kasecie z nawilŇonĢ gĢbkĢ i
pozostawię w temp. pokojowej przez 15 minut.
WyraŅna aglutynacja krwinek Rh+ z surowicĢ anty-D i brak aglutynacji w pozostaþych
kroplach Ļwiadczy o aktywnoĻci odczynnika i braku reakcji nieswoistych.
UWAGA
Dla stwierdzenia wymaganej aktywnoĻci odczynnika papainowego naleŇy porwnaę miano i
natħŇenie aglutynacji wyraŇone w score (str. ) surowicy diagnostycznej anty-D z krwinkami
Rh+ w teĻcie koloidowym i papainowym. Miano surowicy z zastosowaniem Ļrodowiska
papainy, przewyŇszajĢce conajmniej dwa rozcieıczenia i dwukrotnie wyŇsza wartoĻę score niŇ
w Ļrodowisku koloidowym, wskazuje na prawidþowĢ aktywnoĻę odczynnika.
3.3.5. Roztwr wersenianu sodowego (EDTA-Na 2 )
1. 5 g EDTA-Na 2 rozpuĻcię w 100 ml 0,15 mol/l roztworu NaCl.
2. Krew pobiera siħ w proporcji: 1 obj. roztworu EDTA-Na 2 i 9 objħtoĻci krwi.
3. Natychmiast po pobraniu krwi naleŇy dokþadnie wymieszaę zawartoĻę probwki.
UWAGA
Zamiast roztworu EDTA-Na 2 uŇywa siħ czħĻciej EDTA-K 2. ; w zwiĢzku z tym w tekĻcie stosuje
siħ skrt EDTA.
3.3.6. Roztwr trombiny
1. Do macierzystego roztworu trombiny dodaę takĢ iloĻę roztworu NaCl aby otrzymaę roztwr
o stħŇeniu 50j./ml.
2. Przygotowany roztwr trombiny rozlaę w maþych objħtoĻciach (6 - 8 kropli) do probwek
lub fiolek i przechowywaę w zamroŇeniu.
Sposb uŇycia: do 7 - 10 ml krwi dodaje siħ 2 krople roztworu trombiny.
3.3.7. Roztwr polibrenu
BezpoĻrednio przed badaniem przygotowaę 1% roztwr polibrenu w 0,15 mol/l NaCl o pH 7,0.
UWAGA
Polibren w substancji naleŇy przechowywaę w szczelnie zamkniħtym pojemniku ze wzglħdu na
jego silne wþaĻciwoĻci higroskopijne.
3.3.8. Odczynnik MEP do rozkþadu autoprzeciwciaþ na krwinkach przed ich uŇyciem do
autoabsorpcji
1. Przygotowaę 0,1 mol/l roztwr 2-merkaptoetanolu (2ME) w roztworze NaCl o pH 7,3 Î 7,4.
2. Do 20 kropli 0,1 mol/l rozworu 2ME dodaę 5 kropli odczynnika papainowego i 20 kropli
0,15 M roztworu NaCl. CaþĢ zawartoĻę dokþadnie wymieszaę.
UWAGA
Odczynnik MEP przygotowuje siħ bezpoĻrednio przed uŇyciem.
Sposb uŇycia: Dwie objħtoĻci odczynnika miesza siħ z jednĢ objħtoĻciĢ osadu krwinek z krwi
pobranej na EDTA-Na 2.
3.3.9. Roztwr 2ME do rŇnicowania przeciwciaþ IgG i IgM
Przygotowaę 0,1 mol/l roztwr 2ME w buforze fosforanowym o p 7,3 Î 7,4.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin