Biochemia - skrypt.pdf - a - teksty 3 - pid_j

SKRYPT

DO ZAJ ĘĆ LABORATORYJNYCH Z BIOCHEMII DLA STUDENTÓW

POŁO ś NICTWA 2007/2008

ENZYMY

ĆWICZENIE LABORATORYJNE I

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Budowa enzymów.

2. Podział enzymów na klasy i ogólne reakcje dla kaŜdej klasy enzymów.

3. Metody wykrywania aktywności enzymów w materiale biologicznym.

WPROWADZENIE

Enzymy są białkami, które w układach biologicznych pełnią funkcję biokatalizatorów, zwiększają

szybkość reakcji i tym samym obniŜają czas osiągnięcia stanu równowagi. Enzym wykazuje swoją

aktywność tylko wtedy, kiedy istnieją optymalne dla niego warunki. Dotyczy to utrzymania

odpowiedniego pH, właściwej temperatury oraz obecności ewentualnych aktywatorów i kofaktorów.

W przeciwieństwie do katalizatorów niebiałkowych większość enzymów charakteryzuje się wysoką

specyficznością substratową, tzn. kaŜdy z nich katalizuje przekształcenie jednego lub kilku

pokrewnych substratów.

O specyficzności substratowej enzymu decyduje część białkowa - apoenzym, w której

zlokalizowane jest tzw. centrum aktywne, miejsce do którego przyłącza się substrat. Jest to kilka

łańcuchów bocznych aminokwasów, które dzięki strukturze przestrzennej enzymu znajdują się blisko

siebie, bardzo często w obszarze hydrofobowym. Cząsteczka substratu moŜe przyłączyć się do

enzymu tylko wtedy, kiedy jest przestrzennie dopasowana do centrum aktywnego. Substrat zostaje

związany z enzymem licznymi, słabymi oddziaływaniami, w których uczestniczą grupy łańcuchów

bocznych aminokwasów centrum aktywnego, a następnie zostaje przekształcony w produkt, który

odłącza się od enzymu.

Jest wiele enzymów, które wymagają do swojego działania koenzymu - grupy niebiałkowej, która

uczestniczy w katalizowanej reakcji pełniąc rolę kosubstratu. MoŜe być ona połączona z apoenzymem

silnym wiązaniem kowalencyjnym i stanowi wtedy grupę prostetyczną enzymu lub wiązania są słabe i

koenzym łatwo odłącza się od apoenzymu. W wiązaniu koenzymu z apoenzymem często uczestniczy

dwuwartościowy kation. Budowa koenzymów jest róŜnorodna, bardzo wiele z nich zawiera w swoim

składzie witaminę z grupy B.

Typ reakcji katalizowanej przez enzym stał się podstawą klasyfikacji enzymów. Zgodnie z tą

zasadą Międzynarodowa Unia Biochemiczna dokonała podziału enzymów na sześć głównych klas, a

kaŜdy enzym uzyskał ściśle określający go numer klasyfikacyjny.

Pierwszą klasą enzymów są oksydoreduktazy. Enzymy naleŜące do tej klasy katalizują reakcje

utleniania i redukcji. Do tej klasy naleŜą takie grupy enzymów jak: dehydrogenazy, reduktazy,

peroksydazy, oksydazy. Niektóre z nich wymagają do swojego działania koenzymów (np. NAD + ,

NADP + , NADPH+H + , FAD).

Drugą klasą są transferazy , enzymy katalizujące reakcje, w których dochodzi do przeniesienia

jakiejś grupy z jednego substratu na drugi. Niektóre transferazy wymagają do swojego działania

koenzymów (np. fosforanu pirydoksalu, pirofosforanu tiaminy). Do tej klasy naleŜą takie grupy

enzymów jak: aminotransferazy, acylotransferazy, kinazy (fosfotransferazy). Ogólna reakcja

katalizowana przez transferazy: A + B -X

A-OH

+ BH.

A-X + B.

Hydrolazy (trzecia klasa enzymów) katalizują reakcje hydrolizy, nie wymagają do swojego

działania koenzymów. Większość enzymów tej klasy charakteryzuje się niską specyficznością

substratową, skierowaną w stosunku do typu hydrolizowanego wiązania. Do tej klasy naleŜą np.:

glikozydazy, esterazy, peptydazy. Ogólna reakcja katalizowana przez hydrolazy: A-B + H 2 O

Liazy (czwarta klasa) katalizują reakcje niehydrolitycznego rozpadu wiązań lub syntezy, która

przebiega bez dostarczenia energii z rozpadu ATP. NaleŜą tu takie grupy enzymów jak: syntazy,

dekarboksylazy. Ogólna reakcja katalizowana przez liazy: A-B ↔ A + B.

Izomerazy (piąta klasa) katalizują reakcje izomeryzacji: A-B-C ↔ A-C-B. NaleŜą tu między

innymi: mutazy, epimerazy, racemazy.

Ligazy (szósta klasa) przeprowadzają reakcje syntezy wiązań, które wymagają energii najczęściej

z rozkładu ATP: A + B + ATP

A-B + ADP + P i . Syntetazy i karboksylazy to grupy enzymów

naleŜące do tej klasy.

Oznaczanie aktywności enzymów w materiale biologicznym polega na pomiarze szybkości reakcji

katalizowanej przez enzymy, tzn. na określeniu zmiany stęŜenia (ilości) substratu lub produktu w

jednostce czasu (przy uŜyciu enzymu pochodzącego z określonej masy materiału biologicznego np. 1

g tkanki lub 1 cm 3 osocza). Jednostka enzymatyczna (U) jest to ilość enzymu, która katalizuje

przekształcenie 1 mikromola substratu w ciągu 1 minuty, w temperaturze 25 0 C, w warunkach

optymalnych dla danego enzymu.

Celem ćwiczenia jest oznaczanie aktywności wybranych enzymów z klasy oksydoreduktaz,

transferaz i hydrolaz, w optymalnych dla nich warunkach środowiska.

CZ ĘŚĆ DO Ś WIADCZALNA

Przykłady działania enzymów z ró Ŝ nych klas

Oksydoreduktazy – pierwsza klasa enzymów

1. Wykrywanie aktywno ś ci katalazy

Katalaza katalizuje reakcję dysmutacji:

H 2 O 2 + H 2 O 2 → 2H 2 O + O 2

Katalaza jest hemoproteiną o bardzo duŜej aktywności katalitycznej. Występuje we wszystkich

tkankach u zwierząt, głównie w krwinkach czerwonych, wątrobie i nerce.

Zasada metody

W obecności katalazy następuje rozpad H 2 O 2 do wody i tlenu; wydzielanie się pęcherzyków gazu

świadczy o obecności enzymu.

Materiał i odczynniki

1. 3% roztwór H 2 O 2 .

2. Krew.

3. Krew zagotowana

Wykonanie do ś wiadczenia

Do 2 cm 3 wody dodać jedną kroplę krwi. Roztwór przelać do dwóch probówek, zawartość jednej z

nich zagotować. Po oziębieniu do obu probówek dodawać kroplami 3% roztworu H 2 O 2 , o obecności

katalazy świadczy tworzenie się obfitej piany.

2. Wykrywanie aktywno ś ci peroksydazy

Reakcja katalizowana przez peroksydazę:

Substrat-H 2 zred. + H 2 O 2 → Substrat utl. + 2H 2 O

Peroksydaza jest enzymem występującym powszechnie w roślinach, szczególnie duŜo tego enzymu

zawiera chrzan. Ma budowę hemoproteinową. Katalizuje reakcję utleniania substratów w obecności

nadtlenku wodoru. U zwierząt występuje w krwinkach czerwonych i komórkach róŜnych tkanek

peroksydaza glutationowa, która w obecności nadtlenku wodoru lub nadtlenków lipidów

przeprowadza utlenienie zredukowanego glutationu. Jej rola to zapobieganie utlenianiu lipidów

błonowych.

A. Z zastosowaniem benzydyny

Zasada metody

W obecności peroksydazy benzydyna ulega utlenieniu przez nadtlenek wodoru do

difenochinonodiiminy, która kondensując z cząsteczką zredukowanej benzydyny tworzy błękit

benzydynowy (Rys. 1).

Materiał i odczynniki

1. 1% roztwór benzydyny w lodowatym

kwasie octowym.

2. 3% roztwór H 2 O 2 .

3. Sok ziemniaczany.

4. Ziemniak surowy.

5. Ziemniak gotowany.

Wykonanie do ś wiadczenia

Przygotować odczynnik benzydynowy:

zmieszać równe objętości roztworu

benzydyny w lodowatym kwasie octowym i

roztworu H 2 O 2 . Do dwóch probówek

odmierzyć po 1 cm 3 soku ziemniaczanego. Jedną z nich ogrzać do wrzenia. Po oziębieniu do obu

probówek dodać po kilka kropli wcześniej przygotowanego odczynnika benzydynowego. Pojawienie

się barwy niebieskiej świadczy o obecności peroksydazy.

Na plasterek surowego ziemniaka nanieść kilka kropli odczynnika benzydynowego. Tę samą

czynność wykonać z plasterkiem ziemniaka gotowanego i porównać obie próby.

B. Z zastosowaniem p-fenylenodiaminy

Zasada metody

obecności

peroksydazy p-

fenylenodiamin

a ulega

utlenieniu przez

nadtlenek

wodoru do p-fenylenodiiminy, która jest związkiem barwnym (Rys. 2).

Materiał i odczynniki

1. 0,1% roztwór H 2 O 2 .

2. 1% roztwór p-fenylenodiaminy.

3. 0,01 mol/dm 3 bufor Tris-HCl pH 7,4.

4. Sok ziemniaczany.

Wykonanie do ś wiadczenia

Do dwóch probówek odmierzyć po 0,5 cm 3 soku ziemniaczanego. Jedną z nich ogrzać do wrzenia.

Po oziębieniu do obu dodać po 1 cm 3 0,1% roztworu H 2 O 2 , 0,5 cm 3 0,01 mol/dm 3 buforu Tris-HCl pH

7,4 i 0,1 cm 3 1% roztworu p-fenylenodiaminy, wymieszać. Pojawienie się barwy świadczy o

obecności peroksydazy.

3. Wykrywanie aktywno ś ci dehydrogenazy mleczanowej (LDH - ang. lactate dehydrogenase )

Dehydrogenaza mleczanowa występuje w cytoplazmie komórkowej. Jej koenzymem jest NAD.

Katalizuje odwracalną reakcję utleniania mleczanu do pirogronianu (Rys. 3). Enzym składa się z

czterech podjednostek. W organizmie ludzkim występują dwie genetycznie uwarunkowane formy

podjednostek: H (przewaŜająca w mięśniu sercowym) i M (przewaŜająca w wątrobie i mięśniach

szkieletowych). Podjednostki róŜnią się między sobą budową i własnościami immunologicznymi,

tworzą jednak łatwo hybrydy. W tkankach i surowicy krwi LDH występuje w postaci pięciu

izoenzymów. Izoenzymy to róŜne formy enzymu, które katalizują tę samą reakcję, ale róŜnią się

między sobą właściwościami fizykochemicznymi. Zgodnie z przyjętą nomenklaturą izoenzymy te

noszą kolejne numery, zaleŜnie od ich ruchliwości podczas elektroforezy. Najszybciej wędrujący do

anody izoenzym to LDH 1 . Izoenzymy LDH mają następującą budowę: LDH 1 - H 4 , LDH 2 - H 3 M 1 ,

LDH 3 - H 2 M 2 , LDH 4 - H 1 M 3 , LDH 5 - M 4 .

Dehydrogenaza mleczanowa występuje we wszystkich tkankach człowieka. Największą aktywność

LDH odnotowano w mięśniach, nerce, wątrobie i krwinkach czerwonych.

Oznaczanie aktywności izoenzymów dehydrogenazy mleczanowej w surowicy krwi ma znaczenie

diagnostyczne w zawałach mięśnia sercowego (wzrasta stęŜenie LDH 1 ) i uszkodzeniach komórek

wątrobowych (wzrasta stęŜenie LDH 5 ).

Zasada metody

Dichlorofenoloindofenol (DCPI) redukowany jest przez NADH + H + , który powstaje w reakcji

katalizowanej przez LDH (Rys. 4). Sam mleczan nie redukuje DCPI.

Materiał i odczynniki

1. 0,01 mol/dm 3 bufor Tris-HCl pH 7,4.

2. 0,008% roztwór DCPI.

3. 0,5 mol/dm 3 roztwór mleczanu sodu.

4. Homogenat wątroby.

Wykonanie do ś wiadczenia

Do dwóch probówek dodać odczynniki według tabeli 1.

Tabela 1.

Ilości dodawanych odczynników w cm 3

0,01 mol/dm 3 bufor Tris-HCl pH 7,4

0,007% DCPI

0,5 mol/dm 3 mleczan sodu

0,4

5% homogenat wątroby

0,5

homogenat wątroby zagotowany

0,5

Zawartość probówek wymieszać. Probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37 0 C i

obserwować zmiany zachodzące w czasie. Odbarwienie roztworu świadczy o obecności

dehydrogenazy mleczanowej.

4. Wykrywanie aktywno ś ci oksydazy difenolowej

Oksydaza fenolowa (enzym roślinny) jest miedzioproteiną. Katalizuje utlenianie difenoli do

chinonów, które są związkami barwnymi. Akceptorem elektronów jest tlen cząsteczkowy (Rys. 6).

Zasada metody

Pod wpływem oksydazy difenolowej znajdującej się w ziemniaku difenole zawarte w Ŝywicy

gwajakowej utleniają się do produktów, które mają niebieskie zabarwienia.

Materiał i odczynniki

1. 6% roztwór Ŝywicy gwajakowej w 96% etanolu.

2. Ziemniak surowy.

3. Ziemniak gotowany.

Wykonanie do ś wiadczenia

Kawałek ziemniaka świeŜego i ugotowanego zwilŜyć kilkoma kroplami nalewki gwajakowej.

Transferazy – druga klasa enzymów

Biochemia - skrypt.pdf

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: