I. Reakcje antygen-przeciwciało
Immunizacja zwierząt-szczepianie zwierząt, wytworzenie przeciwciał w odpowiedzi poliklonalnej - mieszanina różnych przeciwciał ,
Surowica monowalentna- reaguje z 1 antygenem
Surowica poliwalentna- reaguje z wieloma antygenami
Przeciwciała monoklonalne otrzymuje się łacząc limfocyty z komórkami nowotworowymi (produkują przeciwciała poza organizmem)
Metody jakościowe
1.Reakcja precypitacji w roztworze
-dotyczy antygenów wielodeterminantowych i co najmniej 2 wartościowych przeciwciał rozpuszczonych w roztworze
-słabe siły, niekowalencyjne, utrzymują kompleks immunologiczny
-większość kompleksów Ab-Ag zależy od stosunku stężeń obu składników,
- ilość składników ma wpływ na strukturę powstających kompleksów
-gdy rosnące stężenia antygenu dodaje się do stałej ilości przeciwciał, ilość tworzonych kompleksów immunologicznych rośnie, a następnie maleje. Powstała w ten sposób krzywa Heidelberga ma 3 strefy:
· strefa nadmiaru przeciwciał :ilość antygenu jest zbyt mała ,aby przereagować i wytrącić wszystkie przeciwciała , w nadsączu obecne wolne przeciwciała
· strefa równowagi(ekwiwalencji): ilość antygenu jest wystarczająca ,aby przereagować i wytrącić wszystkie przeciwciała , w nadsączu brak wolnych przeciwciała i wolnego antygenu, tworzą się makromolekuły-max. efekt zmętnienia
· strefa nadmiaru antygenu : ilość antygenu przewyższa ilość wymaganą do wytrącenia wszystkich przeciwciał, zmniejsza się ilość kompleksów -rozpadają się one w nadmiarze antygenu( konkurencja o miejsce w przeciwciałach)
2.Reakcje precypitacji w żelu: podwójna dyfuzja wg Ouchterlony’ego
-umożliwia rozróżnienie reakcji antygenu z różnymi przeciwciałami obecnymi w surowicy(surowica poliwalentna-reaguje z wieloma antygenami) - odczyn podwójnej dyfuzji w żelu
-w zastygłym na szkiełkach żelu agarozowym wycina się studzienki, w których umieszcza się roztwory Ab i Ag, które promieniście dyfundują
-czas:10-12h
-w wyniku reakcji powstaje linia precypitacyjna, jeśli zostanie zachowany warunek równowagi
-położenie linii zależy od stężeń składników lub wielkości cząsteczek
-możliwość badania relacji miedzy przeciwciałami:
· identyczność: łagodne przejście -łuki precypitacyjne wytworzone pomiędzy przeciwciałem a 2 Ag łączą się - Ab precypituje identyczne epitop w każdym z 2 testowanych Ag
· brak identyczności: Ab rozróżnia 3 różne antygeny tworzące niezależne linie, wieksze Ag dyfunduja wolniej
· częściowa identyczność: ostroga + linia identyczności - Ag maja wspólny 1 epitop,a dodatkowo jeden z nich ma 2 epitop
-zastosowanie: diagnostyka białek w moczu
-czułość metody: 20µg/ml - 2mg/ml
3.Immunoelektroforeza (elektroimmunodyfuzja)
-zastosowanie:gdy dużo antygenów w mieszaninie
-przed uwidocznieniem reakcji na drodze precypitacji antygeny rozdziela się w oparciu o ich ładunek elektryczny
-antygeny ze studzienek wyciętych w zelu sa rozdzielane w polu elektrycznym
-pH żelu jest tak dobrane,ze białka naładowane + wędrują do katody,a - do anody.
-pomiedzy studzienkami wycina się rowek i wypełnia się go przeciwciałami
-Ab i Ag dyfunduja do żelu i tworza łuki
-miano surowicy- najniższe stężenie surowicy odpornościowej, które daje jeszcze widoczną reakcję precypitacji dla małego stężenia antygenu
Metody ilościowe
4.Immunodyfuzja radialna
-pozwala na ilościowa ocenę reakcji i antygenów
-Ab dodaje się do żelu przed jego zestaleniem na szkiełku
-do wyciętych w żelu studzienek dodaje się te same obj. standardu o różnych stężeniach i badanych próbek
-24h inkubacja
-Ag dyfunduje tworząc kompleksy az do ustalenia się stanu równowagi, co ujawnia się powstaniem pierścienia precypitacji
-pole krążka(d²) jest proporcjonalne do stężenia antygenu
-wartości nieznane odczytuje się z krzywej standardowej
5.Elektroforeza przeciwprądowa
-wykonuje się w żelu, którego pH jest tak dobrane, aby Ab miało ładunek dodatni Ag ujemny
-jest to możliwe w większości wypadków, bo Ab maja stosunkowo wysoki punkt izoelektryczny ( są obojętne w bardziej zasadowym pH niż większość Ag)
-gdy ładunki antygenu i przeciwciała nie różnią się wystarczająco, można dokonać modyfikacji chemicznej aby zmianie ich punkt izoelektryczny
-po umieszczeniu w polu elektrycznym Ag i Ab zbliżają się do siebie i powstaje precypitat
-czułość:10-20 razy wyższa niż w podwójnej precypitacji
6.Elektroeforeza rakietowa
-ilościowa metoda elektroforetyczna w obecności specyficznych przeciwciał znajdujących się w żelu
-pozwala na oznaczenie stężenia Ag dokonując jego elektroforezy w żelu zawierającym Ab
-odpowiednio dobrane pH sprawia ze Ab nie mają ładunku, a Ag ma ładunek ujemny
-tworzące się precypitaty mają kształt rakietek, w których wysokość jest proporcjonalna do stężenia antygenu
-wartości badanych próbek oblicza się z krzywej standardowej
7.Metoda nefelometrii
-ocenia stężenie r-ru powstałe w wyniku reakcji miedzy Ag a specyficznym Ab
-ocenia osłabienie wiazki świetlnej po przejściu przez roztwór
-ocenia stopień rozproszenia wiązki świetlnej (detektory nastawione miedzy 45º-90º)
- metoda analizy stężenia lub składu molekularnego roztworu na podstawie pomiaru natężenia światła rozproszonego przez zawiesinę.
- wykorzystywany jest efekt Tyndalla
-zalety: szybka, jednostopniowa
-przy małych stężeniach, niskocząsteczkowe kompleksy
-stosuje się krzywą standardową
II. Wykrywanie paraproteinemii i dysproteinemii
Paraproteiny- białka monoklonalne- jednakowe, pochodzą z 1 źródła, pojawiają się w stanach chorobowych w skutek uzlośliwienia komórek produkujących przeciwciała np. limfocytów B. Te przeciwciała przypominaja strukturalnie Ig, ale najczęściej nie maja funkcji biologicznej. Białka te mogą być również zdefragmentowane lub w postaci łańcuchów ciężkich lub lekkich.
1.Elekroforeza w żelu agarozowym
-technika stosowana przy rozdziale , analizie i oczyszczaniu białek
-pozwala określić liczbę występujących frakcji białkowych w surowicy krwi(pH 8,6)
· albuminy
· α1
· α2
· β1
· β2
· γ -szeroki
-polega na ruchu naładowanych cząsteczek lub ich kompleksów względem nieruchomej cieczy pod wpływem przyłożonego napięcia
-podczas elektroforezy możliwe jest rozdzielenie cząsteczek o tej samej wielkości, ale zróżnicowanych pod względem kształtu
-metoda szybka, prosta, powszechnie stosowana.
-zdolność rozdzielcza zależy od wielkości porów w żelu , których rozmiary są zdeterminowane przez stężenie agarozy.
-przeciwciała wędrują z różnymi klasami białek np. IgG od γ do α2 (głównie z γ)
-bialka monoklonalne-zwarte pasma o dużej barwliwości
-białka poliklonalne-szerokie pasma silnie wysycane barwnikiem
2.Immunoelektroforeza prosta wg Scheideggera
-2 etapowa
· etap I: rozdziała elektroforetyczny mieszaniny antygenów w żelu agarozowym (podział ze względu na ładunek i mase)
· etap II: immunodyfuzja antygenów i przeciwciał, które dodaje się do żelu wzdłuż drogi rozdziału
-w wyniku reakcji Ab+Ag powstają linie precypitacyjne zwane łukami, których położenie, kształt, wielkość, wybarwienie porównuje się z płynem kontrolnym (mieszanina Ag w prawidłowych stężeniach)
-użycie surowicy monowalentnej-pojedyncze łuki
- użycie surowicy poliwalentnej-wiele łuków
-interpretacja obrazów immunoforetycznych- porównanie wyników z płynem kontrolnym w tych samych warunkach i tym samym czasi
-przy ocenie bierze się pod uwagę zmiany jakościowe i ilościowe, które mogą być wyrażone przez:
· obecność lub brak danej linii precypitacyjnej
· szerokość wyników ć, kształt, położenie łuku
· ostrość obrazu
· intensywność barwy precypitatu
· zmianę w ruchliwości elektroforetycznej frakcji
· pojawienie się dodatkowych łuków
-kontrola u góry, pacjent na dole
-do badania trzeba mieć poliwalentne i monowalentne przeciwciała IgG, IgM, IgA łańcuchy lekkie
-fizjologicznie więcej przeciwciał ma łańcuchy κ niż λ (stała gatunkowa: 2/3 : 1/3)
-stosunek κ do λ ma znaczenie diagnostyczne
κ
λ = 1,2 - 2,6 (zawsze przewaga κ)
-przy pojawieniu się paraprotein będzie wzrastał lub malał
-przy hipo i hiperimmunoglobulinemi nie zmienia się
-zniekształcenie łuków precypitacyjnych-komórki prawidłowe ubywają a komórki nowotworowe wytwarzają więcej przeciwciał (pogrubienie łuków w tym miejscu)
-brak albumin- inne białka przejmuja ich funkcje
-zastosowanie:
· do określania czystości wyizolowanego antygenu
· do kontroli procesu immunizacji
· do określania specyficzności przeciwciał
-wady:
-niska czułość(60%)
-trudna interpretacja
-stosunkowo długi czas odczytywania wyników(min 48h)
-zalety
+ilość informacji o pacjencie
3.Immunofiksacja
· etap I: rozdział elektroforetyczny mieszaniny antygenów w żelu agarozowym w kilku powtórzeniach(ok. 6) w tym samym czasie
· etap II: immunoprecypitacja antygenów w reakcji ze swoistymi Ab
-tworzą się pasma precypitacyjne w wyniku reakcji Ag-Ab, których położenie porównuje się z rozdziałem kontrolnym pacjenta
-1 ścieżka: kontrolna własna pacjenta
-pozostałe ścieżki: IgG, IgM, IgA, κ , λ
-zatrzymywane sa tylko duze kompleksy, a to co nie utworzy kompleksów jest wypłukiwane i tego nie widzimy
-wymaga bardzo dobrej jakości przeciwciał monoklinalnych, które sa bardzo drogie
-zalety:
+szybkość: 2-3h
+łatwość interpretacji
+czułoćś(>90%)
Paraproteiny
-zbudowane często tylko z 1 typu łańcuchów lekkich lub ciężkich
-w elektroforezie homogenie białko wedruje w postaci wąskiego ograniczonego pasma
4.Immunoelektroforeza dwuwymiarowa(krzyżowa)
· etap(wymiar) I: elektroforeza wysokonapięciowa -rozdział Ag w żelu agarozowym (szybko-30min)
· etap II: elektroforeza niskonapięciowa -rozdział Ag w obecności Ab prowadzony pod kątem 90º do pierwszego (wolno)
-wynik reakcji: łuki precypitacyjne,których pole powierzchni jest wprostproporcjonalne do stężenia Ag, a odwrotnieproporcjonalne do stężenia Ab
-cel: jakościowe badanie różnic w składzie białek
-kilka szczytów połaczonych 1 linią - Ab są podobne antygenowo
-kilka szczytów przecinających się - odrębne Ab
III.Zastosowanie technik immunoenzymatycznych fazy stałej w diagnostyce medycznej
Reakcja Ab-Ag daje wielkie, usieciowane, precypitujące kompleksy.
Kompleksy w żelu nie zawsze precypitują.
...
edvin