wyklad13 genomika.doc

Patofizjologia – Wykład 13

Genomika a proteomika

Dotychczasowe metody analizy nie pozwalają ocenić całościowo stanu komórki.

Nowy rozdział w biologii molekularnej:

•         Geny funkcjonują w sieci wzajemnych zależności

•         Aktywacja genu w komórce jest równoznaczna z syntezą odpowiedniego mRNA (transkryptu), na matrycy którego powstaje białko

•         Wykrycie mRNA jest dowodem ekspresji genu, a liczba kopii mRNA jest miarą ekspresji genu

•         Ekspresja genów zmienia się w odpowiedzi na sygnały zewnętrzne
i wewnętrzne

•         Tradycyjna biologia molekularna zakłada badanie jednego genu
w jednym doświadczeniu, co uniemożliwia uzyskanie obrazu całościowego.

Jak dotychczas badano ekspresję genów?

•         Analiza northern-blotting

–          czuła, ale półilościowa

–          pracochłonna, tylko kilka genów równocześnie

•         Q-PCR (TaqMan)

–          ilościowa analiza metodą PCR w czasie rzeczywistym

–          drogie sondy, kilka-kilkanaście genów na raz

•         Differential Display
(porównanie ekspresji losowo namnożonych fragmentów RNA)

–          analizuje wiele genów

–          ryzyko wyników fałszywie dodatnich

•         Analiza dot blot (macroarrays)

–          ograniczona czułość

Wszystkie metody oparte są na hybrydyzacji badanego mRNA
z sondą o znanej sekwencji

•         SAGE (sekwencyjna analiza ekspresji genów)

–          czuła, analizuje wiele genów, również o nieznanej sekwencji

–          wymaga znacznych umiejętności technicznych

Chcemy badać komórkę poprzez jednoczesną analizę
stanu wszystkich jej elementów (genów lub białek)

geny (DNA)                                         GENOMIKA

    ↓

transkrypty genów (mRNA)    „TRANSKRYPTOMIKA”

    ↓

białka                                                 PROTEOMIKA

Od mRNA do cDNA

Komórki z różnych tkanek→ mRNA wyizolowane z komórek→ klony cDNA otrzymane z cząsteczek mRNA

Znakowanie fluorochromem i hybrydyzacja:

n      po izolacji mRNA podlega odwrotnej transkrypcji, w czasie której jest znakowane fluorochromem

n      znakowana nić cDNA jest hybrydyzowana do DNA znajdującego się na mikromacierzy

n      detekcja sygnału fluoroscencyjnego umożliwia ocenę obecności danego transkryptu w pierwotnej próbce

Macierze cDNA:             
Porównawcza analiza ekspresji genów

cDNA z obydwu porównywanych typów tkanek znakujemy dwoma różnymi fluorochromami i hybrydyzujemy wspólnie na jednej sondzie.

Mikromacierze DNA: oligo czy cDNA?

CGH do mikromacierzy:

1. Czułość metody HR-CGH ~ 3-5 Mb

2. Zwiększenie rozdzielczości poprzez zastąpienie chromosomów metafazowych klonami BAC oraz PAC

3. Rozdzielczość metody zależy od wielkości  użytych klonów oraz odległości miedzy nimi w genomie – rozdzielczość 1Mpz wymaga użycia 3,500 klonów

Rodzaje i zastosowanie CGH do mikromacierzy:

•         Mikromacierz skonstruowana dla określonego regionu chromosomu

              -  region 1p36 -   Yu W i wsp.,2003,

              -  region 15q   –   Locke i wsp.,2004,

              -  region 18q   –   Veltman JA i wsp., 2004,

              -  region 17p   –   Shaw CJ i wsp.,2004

•         Mikromacierz kliniczna, zawiera klony bakte-ryjne specyficzne dla regionów krytycznych zespołów genetycznych oraz regiony subtelo-merowe

              (Cheung SW i wsp.,2005, Shaffer L i wsp., 1999)

•         Mikromacierz sporządzona dla całego genomu

Zastosowania mikromacierzy:                                                                                                        początek
nowej ery w biologii molekularnej?

•         genotypowanie – np. porównawcza hybrydyzacja (matrix CGH), detekcja mutacji, ocena polimorfizmów

•         mapowanie

•         badanie profilu ekspresji genów („transcriptomics”) – możliwa ocena ilościowa!

–          różnice w ekspresji genów pomiędzy tkankami

–          profil ekspresji genów podczas rozwoju

–          ekspresja genów w zdrowiu i chorobie (np. porównanie nowotworu i tkanki zdrowej)

–          wpływ leków na procesy zachodzące w komórkach

•         badanie profilu ekspresji przez analizę białek komórkowych (proteomika)

W znaczeniu absolutnym proteom jest nieosiągalny podobnie jak horyzont

Jest zjawiskiem dynamicznym, a nie statycznym

Modyfikacje potranslacyjne:

fosforylacja                                          aktywność

glikozylacja                                          stabilność

sulfatacja                       lokalizacja

metylacja                                              przemiana

acetylacja                                             (metabolizm)

Zadania HUPO:

-  Działania na rzecz powszechnego dostępu drogą elektroniczną do wyników badań

- Odstąpienie od zasady patentowania wyników prac badawczych zarówno w ośrodkach akademickich jak i przemysłowych

- Właściwa koordynacja badań w zakresie merytorycznym i finansowym

- Opracowanie definicji proteomu w plazmie

- Występowanie z propozycjami zakresu badań w  określonych typach komórek

- Działania na rzecz utworzenia konsorcjum mającego na celu wytworzenie przeciwciał dla wszystkich białek człowieka

- Skatalogowanie pierwotnej struktury wszystkich białek

- Mapowanie wszystkich organelli i uzyskanie ich w postaci oczyszczonej (sub-proteomika)

- Opracowanie map interakcji między białkami w modelowych organizmach

- Integracja badań w zakresie proteomiki i genomiki

- Rozwój metod informatycznych i budowa odpowiedniej infrastruktury

Efekty HUPO:

·         Identyfikacja kompleksu-1 w stwardnieniu guzowatym

jako fizjologicznie występującego substratu białkowej kinazy B (PKB)

dzięki integracji danych z wykorzystaniem algorytmu ScanSite tylko na podstawie metod elektroforetycznych z uwzględnieniem ilości fragmentów sekwencji specyficznych dla PKB

·         Badania nad Neurokininą B (NKB)

w stanach przedrzucawkowych wzrost poziomu NKB

W badaniach cytotrofoblastu wzrost transkrypcji RZR alfa, obniżona transkrypcja c-abl, CD40 oraz lekkiego łańcucha dyneiny cytoplazmatycznej (genomika)

Obniżony poziom 21 białek NKB zależnych, związanych klinicznie ze stanem przedrzucawkowym (m. in. thoredoxin – udział w obronie przed stresem oksydacyjnym; annexin II – wewnątrznaczyniowe procesy trombolityczne; białko wiążące fosfanetanolaminę/inhibitor kinazy Raf – odpowiedź zapalna) (proteomika)

·         Badania nad proteomem powierzchni komórki

Wykrycie szeregu nowych białek na powierzchni komórek nowotworowych

·         Badania „in situ” w tkankach nowotworowych

z użyciem macierzy indukowanej laserowo

(matrix-assisted laser desorption/ionization; MALDI)

·         Badania z użyciem przeciwciał dla określonych typów białek – choroby autoimmunologiczne, w tym np. lupus erythematosus

Proteomika – badania proteomu:

•         Skład wszystkich białek w komórce

•         Skład wszystkich izoform i zmodyfikowanych postaci białek

•         Interakcje między białkami

•         Opis struktury białek

•         Tworzenie przez białka złożonych struktur i kompleksów

•         Pełny opis funkcjonowania komórki

-Two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis – 2D PAGE np. profile białkowe w różnicowaniu podtypów białaczek

-Elektroforeza w gradiencie pH (immobilized pH gradient – IPG)stabilizacja gradientu pH w podłożu acrylamidowym

-Spektrometria w oparciu o masę molekularną białek i ich fragmentów (mass spectrometry)

-Badania układów białek z użyciem białek rekombinowanych lub czynników (znaczników)  wchodzących w reakcje z białkami – przeciwciała, peptydy, mikrocząsteczki

-Lokalizacja białek metodami fluorescencyjnymi

GFP – green fluorescent protein

-Fluorescencyjny rezonans przenoszenia energii

FRET – fluorescence resonance energy transfer

-FlexGene Consortium  - kolekcja cDNA niezbędna dla celów

Proteomika – badania proteomu:

·         Badania białek nieaktywnych, kompleksów białek lub megakompleksów na skalę komórki

·         Krystalografia z użyciem promieni X

·         Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)

·         Mikroskopia elektronowa

·         Tomografia elektronowa

Geny „kandydujące” w etiopatogenezie PCOS → patrz prezentacja profesora

Stosowane techniki badań polimorfizmów DNA:

·         VNTR minisatellite - variable number tandem repeats

·         SSLP (STRP) - single sequence length polymorphism (short tandem repeat polymorphism)

·         RFLP - restriction fragment length polymorphism

...