dr Romanik
PRELEKCJA 3
Badanie wrażliwości drobnoustrojów na leki, problem lekooporności.
Antybiotyki - substancje o efekcie przeciwdrobnoustrojowym, wytwarzane prze mikroorganizmy (bakterie, grzyby) lub uzyskane na drodze półsyntetycznej bądź syntetycznej, lecz mające naturalny wzorzec.
Chemioterapeutyki - związki o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, uzyskane na drodze syntetycznej, które nie posiadają naturalnego wzorca.
Antybiotyki - podział:
1. naturalne:
- penicylina benzylowa
- glikopeptydy
- aminoglikozydy
- makrolidy
- cefalosporyny
2. półsyntetyczne:
- penicyliny półsyntetyczne
- cafalosporyny
3. syntetyczne:
- aztreonam
- chloramfenikol
Chemioterapeutyki - syntetyczne:
- chinolony
- sulfonamidy
- trimetoprim
Miejsca docelowego działania leków przeciwbakteryjnych:
1. sulfonamidy - zaburzają syntezę puryn w komórce bakteryjnej
2. antybiotyki beta-laktamowe (penicyliny, cefalosporyny, karbapenemy, monobaktamy) i glikopeptydy - zaburzają syntezę ściany komórkowej;
- beta-laktamy działają poprzez białko wiążące penicylinę - PBP, glikopeptydy hamują syntezę ściany komórkowej na etapie transportu substancji.
3. kolistyna, polimyksyna, amfoterycyna B - zaburzają strukturę błony komórkowej
4. Rifampicyna - hamuje aktywność polimerazy RNA
5. chinolony - blokują aktywność gyrazy DNA
6. Chloramfenikol, tetracykliny, aminoglikozydy i makrolidy - działają na polirybosomy bakteryjne
Miejsce docelowego działania leków przeciwgrzybiczych:
1. Echinokandyny (np. caspofungina) - hamują syntezę ściany komórkowej poprzez inhibicję syntetazy 1,3-beta-glukanowej, co skutkuje niestabilnością osmotyczną komórki grzyba i jej lizą
2. Antybiotyki polienowe - wiążą się z błoną komórkową grzyba powodując jej rozerwanie
3. Gryzeofulwina - hamuje reorganizację mikrotubuli śródkomórkowych
4. Alikiloaminy - blokują syntezę ergosterolu w błonie komórkowej poprzez hamowanie epoksydazy skwalenowej
5. Fluorocytozyna - wychwytywana aktywnie przez permeazy, blokuje syntezę RNA i DNA
6. Azole - blokują syntezę ergosterolu w błonie komórkowej poprzez inhibicję 14-alfa-desmetylazy zależnej od cytochromu P450
a) blokowanie syntezy ściany komórkowej:
- beta-laktamy,
b) uszkadzanie błony cytoplazmatycznej:
- polimyksyny
c) blokowanie syntezy białka:
- tetracykliny
- kwas fusydowy
d) blokowanie syntezy DNA:
- ko-trimoksazol
- nitrofurany
- rifamycyny
- metronidazol
Ze względu na sposób działania wyróżniamy antybiotyki:
1. bakteriobójcze:
- beta-laktamy
2. bakteriostatyczne (stosować szczególnie wtedy, gdy bakterie produkują toksyny):
- linkozamidy
- trimetoprim, sulfonamidy
Podział antybiotyków w oparciu o skuteczność przeciwko określonym grupom drobnoustrojów:
1. Skuteczne przeciwko bakteriom Gram(+):
- penicylina G
2. Skuteczne przeciw bakteriom Gram(-):
3. Skuteczne przeciw bakteriom zarówno Gram(+) jak i (-):
- penicyliny o szerokim spektrum działania
4. Skuteczne przeciwko bakteriom beztlenowym:
- penicyliny z inhibitorami beta-laktamaz
- cefoksytyna
5. Skuteczne przeciwko bakteriom atypowym:
- rifampicyna
Metody oznaczania wrażliwości bakterii na chemioterapeutyki:
1. identyfikacja
2. metody jakościowe
3. metody ilościowe
Ropień palca u dziecka - właściwe postępowanie:
- antybiotyków nie podajemy doustnie
- rozcinamy ropnia i opróżniamy
- po przepłukaniu pobieramy materiał do badania mikrobiologicznego
Oznaczenie oporności polega koniec końców na znalezieniu genu oporności w badanych bakteriach.
Metody jakościowe:
a) metoda dyfuzyjna z użyciem krążków bibułowych nasyconych chemioterapeutykami w stężeniach jakie osiągają one w surowicy; metoda podlega standaryzacji zgodnie z zaleceniami:
- NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards
- ICS - International Collaborative Study
b) Metody te różnią się dla poszczególnych grup bakterii. Różnice dotyczą składu podłoży, inokulum, posiewu, warunków i czasu inkubacji oraz interpretacji wyników. Najczęściej wykorzystywanym podłożem jest agar Muellera-Hintona.
Inokulum – liczba komórek bakteryjnych w podłożu płynnym wyrażona jako liczba jednostek tworzących kolonie na mililitr (CFU/ml)
- inokulum może być również określane jako zmętnienie lub gęstość optyczna zawiesiny bakteryjnej
Standard McFarlanda:
- składa się on z serii standardów (rozcieńczeń BaSO4) o różnych zmętnieniach pozwalających na oszacowanie gęstości (stężenia) zawiesiny bakteryjnej
- używany do standaryzacji metod mikrobiologicznych
- standardy te oznaczone są numerami wg skali McFarlanda
Równoważniki:
- stężenia drobnoustrojów zależą od wielkości kolonii, ilości odpowiadają średnim wartościom dotyczącym bakterii; dla drożdżaków, których kolonie są większe, liczba kolonii powinna wynosić ok. 30
- wartość powinna odpowiadać optycznej gęstości zawiesiny, roztwór BaSO4 nie daje takiej samej gęstości optycznej ponieważ rozmiar i cząsteczki różnią się od bakterii i inaczej załamują światło
Metody ilościowe:
a) metody rozcieńczeniowe na podłożu stałym lub płynnym, określające najmniejsze stężenie chemioterapeutyku hamujące wzrost bakterii - MIC w mg/l.
b) metoda seryjnych rozcieńczeń antybiotyku w podłożu płynnym - umożliwia także oznaczenie wartości najmniejszego stężenia bakteriobójczego (MBC)
c) Metoda dyfuzyjna przy użyciu pasków bibułowych nasyconych antybiotykiem w gradiencie stężeń (E-test); stosowana m.in. dla: H. pylori , Campylobacter
Określenie wielkości strefy zahamowania wzrostu (mm) i wielkości MIC:
- pozwala na uzyskanie stężeń granicznych, umożliwiających zakwalifikowanie szczepu do kategorii:
- wrażliwych
- średnio wrażliwych
- opornych
MIC (minimum inhibitory concentration) - najmniejsze stężenie leku wyrażone w mg/l, określane w warunkach in vitro, hamujące wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum w określonym czasie.
MBC – minimalne stężenie leku wyrażone w mg/l, określone w warunkach in vitro, przy którym ginie 99,9% bakterii, przy określonej gęstości inokulum w określonym czasie.
Tolerancja – jest wynikiem braku aktywacji enzymów autolitycznych przez antybiotyk beta-laktamowy, który wykazuje spadek lub brak działania bakteriobójczego bez utraty działania hamującego (nie zmienia się wartość MIC!); przyjęta definicja tolerancji oznacza stosunek MBC/MIC większy lub równy od 32!
Zakres badań lekowrażliwości:
a) antybiogram podstawowy - obejmuje o antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu
- antybiogram podstawowy dla szczepów uzyskanych z moczu obejmuje antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu wobec szczepów izolowanych w zakażeniach układu moczowego
b) antybiogram rozszerzony - zawiera rozszerzoną listę antybiotyków stosowanych wobec drobnoustrojów (również dla szczepów izolowanych w zakażeniach układu moczowego) wieloopornych i/lub izolowanych w ciężkich zakażeniach.
80% zakażeń górnych dróg oddechowych powodowanych jest przez Streptococcus pyogenes:
- wymaz
- wprowadzamy materiał do pojemnika z buforem
- nakrapiamy na płytkę
Infekcja wirusowa zazwyczaj ulega samowyleczeniu. Gdy infekcja się przedłuża - podejrzewamy infekcję bakteryjną i przepisujemy antybiotyk.
Slidex MRSA detection:
a) zasada metody:
- cząsteczki lateksu opłaszczone przeciwciałami anty-PBP2' reagują ze szczepem MRSA powodując aglutynację możliwą do wykrycia okiem nieuzbrojonym
Ostatnio opisano w Japonii i USA szczepy o obniżonej wrażliwości na glikopeptydy: VISA (lub GISA). Fenotyp ten uwarunkowany jest zmianami w strukturze ściany komórkowej gronkowca. Określany jest jako obniżona wrażliwość na wankomycynę (MIC 2-8 mg) i/lub oporność na teikoplaninę → nie należy stosować wankomycyny w leczeniu, ponieważ szczepy są oporne. Szczepy VISA należy weryfikować metodą przeglądową wg NCCLS.
Szczególnie łatwo nabywa oporność na wankomycynę Staphylococcus haemolyticus.
Wykrywanie ESBL – beta-laktamaz o rozszerzonym spektrum działania przy użyciu testu dwóch krążków:
- test wykorzystuje wrażliwość ESBL na inhibitory beta-laktamaz
- powstaje asymetryczne powiększenie strefy zahamowania wzrostu od strony krążka z inhibitorem (które świadczy o synergizmie antybiotyku beta-laktamowego i inhibitora)
Szczepy wytwarzające ESBL są oporne na:
- wszystkie penicyliny
- cafalosporyny I-III generacji (z wyjątkiem cefamycyn)
- monobaktamy
W leczeniu tych szczepów stosujemy:
- antybiotyki innych grup
- połączenie piperacyliny z tazobaktamem (beta-laktam + inhibitor)
- karbapenemy
E-test:
- pełna nazwa: Epsilometer test
- służy do oznaczania wartości MIC
- na krążek z agarem, na który wysiano bakterię nakładany jest nasączony antybiotykiem pasek z narysowaną skalą
- antybiotyk dyfunduje tworząc gradient stężenia w agarze (najczęściej agar MH - Muellera-Hintona)
- powstaje eliptyczna strefa zahamowania wzrostu
- punkt w którym granica strefy zahamowania wzrostu przetnie się z paskiem wyznacza wartość MIC dla badanego szczepu
Przykład E-testu (eliptyczne przejaśnienie – strefa zahamowania wzrostu):
1
cyrylek12