Biotechnologia, Data wykonania ćwiczenia 16.10.2013
Grupa 3, środa 12-15
FERMENTACJA ALKOHOLOWA
1.Fermentacja alkoholowa to beztlenowy niecałkowity rozkład związków organicznych, głównie utlenianie cukrów, przebiega według poniższego schematu:
C6H12O6 →2C2H5OH + 2CO2 + 28 kcalProdukty fermentacji nie mogą być dalej metabolizowane bez udziału tlenu. Pierwsze etapy procesu fermentacji alkoholowej mogą być zbieżne z początkowymi etapami oddychania tlenowego ( np. glikoliza).
Celem fermentacji jest utlenianie cukrów z pewnym niewielkim zyskiem energetycznym- z 1 mola glukozy powstają 2 mole ATP.
Mikroorganizmy przeprowadzające proces fermentacji.
ü Drożdże głównie z rodzaju Saccharomyces (należą do klasy workowców- ascomyces) i do rodzaju drożdży właściwych (Saccharomyces taceaces). Najczęściej stosowane Saccharomyces cerevisiae mogą wytwarzać nawet do 12% etanolu, zaś wolno rosnące Saccharomyces sake nawet do 20%.
ü Bakterie np. Sarcina ventriculli, Zymomonas mobilis, Thermoaerobacter ethanolicus.
Wykorzystanie fermentacji alkoholowej:
ü przemysł spirytusowy
ü przemysł farmaceutyczny
ü przemysł spożywczy
ü przemysł chemiczny
ü produkcja biopaliw
Efekt Pasteura- w warunkach tlenowych fermentacja jest zahamowana, ale następuje intensywny przyrost biomasy drożdży. W warunkach beztlenowych następuje mniejszy przyrost biomasy, ale intensywnie przebiega proces fermentacji .
Odwrotny efekt Pasteura- mimo, iż fermentacja jest procesem beztlenowym to niezbędna jest minimalna ilość tlenu do jej zachodzenia (ok.0,05%). Tlen potrzebny jest do syntezy związków t.j. sterole czy kwas nikotynowy niezbędny do budowy błony komórkowej.
2. Cel ćwiczenia:
ü Wykonanie barwienia przyżyciowego drożdży prasowanych i suszonych w celu określenia liczby żywych i martwych komórek.
ü Badanie wykorzystywania różnych substratów przez drożdże piwowarskie Saccharomyces cerevisiae.
ü Oznaczanie biomasy drożdży w hodowli tlenowej i beztlenowej (efekt Pasteura).
3. Przebieg doświadczeń:
a) Oznaczenie żywotności drożdży - barwienie przyżyciowe drożdży prasowanych:
ü wykonano rozczyn z drożdży, który naniesiono na szkiełko podstawowe;
ü naniesienie kropli błękitu metylenowego i przykrycie szkiełkiem nakrywkowym;
ü zliczenie liczby komórek martwych (zabarwionych) oraz żywych pod mikroskopem przy powiększeniu 60x.
b) Oznaczenie żywotności drożdży - barwienie przyżyciowe drożdży suszonych:
ü rozpuszczenie kilku kuleczek drożdży w niewielkiej ilości wody;
ü naniesienie rozczynu na szkiełko podstawowe, wykonanie barwienia i zliczeń jak wyżej.
c) Wykorzystanie różnych substratów przez drożdże piwowarskie:
ü 3 probówki wyposażone w rurki Durhama zawierające wodę drożdżową, purpurę bromokrezolową i kolejno cukry: glukozę, sacharozę i skrobię zaszczepiono po 0,1 ml zmywu drożdży ze skosu;
ü hodowle inkubowano 3 dni w temp. 30oC.
d) Oznaczanie biomasy drożdży w hodowli tlenowej i beztlenowej:
ü do kolb zawierających 250 ml pożywki mineralnej z dodatkiem sacharozy i melasy zaszczepiono po 1 ml zmywu drożdży ze skosu;
ü w dwóch kolbach zawierających różne substraty umieszczono rurki fermentacyjne wypełnione wodą destylowaną (warunki beztlenowe) i inkubowano w temperaturze pokojowej;
ü dwie kolby zabezpieczone gazą (warunki tlenowe) inkubowano na wytrząsarce;
ü po okresie inkubacji zważono probówkę wirówkową, następnie odwirowano 50 ml hodowli drożdży przy 10 tyś. obr/min, na koniec zważono probówkę wraz z osadem.
4. Wyniki i wnioski:
Poniżej przedstawione są wyniki oraz wnioski do wyżej wymienionych doświadczeń wyszczególnionych w podpunktach a - d.
a,b) Udział komórek martwych obliczono ze wzoru:
X= ba+b*100%
a - średnia liczba komórek bezbarwnych (żywych)
b - średnia liczba komórek zabarwionych (martwych)
W przypadku drożdży prasowanych uzyskano komórek:
- żywych: 336, 304, 290, 320. średnio: 312
- martwych: 16, 25, 12, 20. średnio: 18
X= ok. 5,45%
W przypadku drożdży suszonych uzyskano komórek:
- żywych: 120, 115, 104, 125. średnio: 116
- martwych: 25, 25, 32, 15. średnio: 24
X= ok. 17,14%
ü Liczba komórek martwych nie powinna przekraczać 5 % w drożdżach prasowanych i 25% w drożdżach suszonych. Okazuje się zatem, że drożdże prasowane (spożywcze w postaci kostki) posiadają niewielki odsetek komórek martwych, jednak w wykonanym doświadczeniu w niewielkim stopniu przekraczają odpowiednią ilość (tzn. 5%). Różnica ta może wynikać z niedokładności podczas zliczania komórek. W przypadku drożdży suszonych % komórek martwych nie przekracza 25%, co świadczy o dobrej jakości produktu i dobrze przeprowadzonym doświadczeniu.
c) Po inkubacji sprawdzono obecność CO2 w probówkach zawierających rurki Durhama oraz kolor podłoża.
ü W probówkach z sacharozą i glukozą zaobserwowano zmianę koloru podłoża na żółty, oraz obecność gazu, który świadczy o wykorzystaniu cukrów w procesie fermentacji. Widać także było wzrost biomasy drożdży. Uzyskane wyniki świadczą o zajściu fermentacji. W probówkach ze skrobią nie zaobserwowano zmiany koloru podłoża ani produkcji gazu, więc cukier nie został wykorzystany - brak fermentacji.
ü Drożdże piwowarskie Saccharomyces cerevisiae jako substrat do fermentacji zużywają m.in. sacharozę i glukozę, natomiast nie wykorzystują skrobii jako substratu.
d) Oznaczenia probówek:
Hodowla
Waga probówki wirówkowej [g]
Waga probówki z osadem [g]
Waga osadu - świeża masa drożdży [g]
1-warunki tlenowe, sacharoza
29,6366
31,0307
1,3941
2-warunki beztlenowe, sacharoza
29,4673
30,2790
0,8117
3-warunki tlenowe, melasa
29,4526
30,1328
0,6802
4-warunki beztlenowe, melasa
29,8368
najmniej osadu, struktura luźna, nie udało się oddzielić osadu od płynu
ü Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że warunki tlenowe są korzystniejsze dla rozwoju drożdży, ponieważ w przypadku obu substratów uzyskaliśmy większą świeżą masę drożdży niż w hodowli w warunkach beztlenowych (efekt Pasteura), natomiast porównując użyte substraty wydajniejszą produkcję biomasy uzyskaliśmy przy użyciu pożywki z dodatkiem sacharozy.
Rainhardt