EMSA I FOOTPRINTING.pdf

ćwiczenie 7

ANALIZA ODDZIAŁYWAŃ DNA/BIAŁKO Z WYKORZYSTANIEM TECHNIK

EMSA I FOOTPRINTING

Analiza oddziaływań DNA/białko ma zasadnicze znaczenie w badaniach takich procesów jak transkrypcja,

replikacja oraz naprawa DNA. Aby zrozumieć mechanizm regulacji transkrypcji należy poznać białka pełniące

funkcje czynników transkrypcyjnych (aktywatory, represory) oraz sekwencje DNA (promotory, terminatory,

enhancery, silencery), z którymi czynniki te oddziałują. Ponieważ wiele czynników transkrypcyjnych jest

odpowiedzialnych za regulację określonych grup genów, np. związanych z cyklem komórkowym, aktywność tych

białek ma zasadniczy wpływ na przebieg podstawowych procesów komórkowych, takich jak: proliferacja,

różnicowanie, apoptoza lub onkogeneza.

EMSA

Test EMSA (ang. E lectrophoretical M obility S hift A ssay), zwany również techniką retardacji, wykorzystywany

jest do badań oddziaływań zachodzących pomiędzy białkami a kwasami nukleinowymi. Technika ta wykorzystuje

fakt, że kompleksy DNA/białko migrują w żelach poliakryloamidowych (PAA) z mniejszą szybkością niż same

cząsteczki DNA (Rys. 1). Badane fragmenty DNA, np. promotory, po wyznakowaniu radioaktywnym izotopem,

poddawane są kompleksacji, czyli inkubacji z odpowiednim białkiem. Do eksperymentu można używać zarówno

pełne ekstrakty białkowe, czyli mieszaniny zawierające wszystkie białka obecne w danej tkance, jak i białko

oczyszczone z ekstraktu (homogenne) lub białko rekombinowane, czyli uzyskane z nadekspresji w bakteriach.

Mieszaninę reakcyjną po kompleksacji rozdzielamy w natywnych żelach poliakryloamidowych a pozycję

kompleksów DNA/białko identyfikujemy za pomocą autoradiografii. EMSA umożliwia uzyskanie następujących

informacji na temat oddziaływań DNA/białko:

1. Poznanie, czy badany fragment DNA oddziałuje z białkiem dodanym do reakcji. O oddziaływaniu świadczy

przesunięcie prążka znakowanego DNA w stosunku do próby kontrolnej, pozbawionej białek. Jeżeli w badanym

fragmencie DNA będziemy wprowadzać mutacji, które zniosą zdolność badanej cząsteczki do oddziaływań z

białkiem, możemy tą drogą zidentyfikować pozycje nukleotydowe uczestniczące bezpośrednio w wiązaniu

białka.

2. Ustalenie, jaki jest stopień specyficzności oddziaływań DNA/białko. W każdej komórce, oprócz białek

rozpoznających określony, tzw. specyficzny motywy sekwencji nukleotydowej, znajdują się również białka,

które wiążą się niespecyficznie z DNA, niezależnie od jego sekwencji. Specyficzność oddziaływań można

ustalić dodając dodatkowo do reakcji DNA pełniący funkcję kompetytora. W przeciwieństwie do badanego

fragmentu DNA, kompetytory nie są znakowane, a więc ich kompleksy z białkami nie są widoczne w żelu.

Stosowane są następujące typy kompetytorów:

- kompetytor niespecyficzny służący do eliminacji z żelu prążków niespecyficznych. Jest to DNA, o sekwencji

innej niż badany fragment DNA, np. syntetyczny poli dIxdC. Wiążą się z nim białka o niskiej specyficzności

oddziaływań z DNA. Białka niespecyficzne, po związaniu z tym kompetytorem, nie będą mogły oddziaływać z

DNA badanym (znakowanym), w wyniku czego na żelu nie będą widoczne kompleksy niespecyficzne (Rys.1,

kieszonka 3).

- kompetytor specyficzny służący do eliminacji z żelu prążków specyficznych. Jest to nieznakowany DNA o

sekwencji identycznej z DNA badanym (znakowanym). Dodany reakcji wiążę białka specyficzne

uniemożliwiając ich oddziaływanie ze znakowanym DNA. W efekcie, w próbach zawierających ten

kompetytor nie widzimy kompleksów specyficznych, które są obecne w próbach pozbawionych tego

kompetytora. Wynik ten potwierdza wysoką specyficzność tych kompleksów (Rys.1, kieszonka 4).

3. Ustalenie warunków, w jakich dochodzi do wiązania danego białka z DNA, tj. pH, stężenie poszczególnych

soli, temperatura, obecność kofaktorów lub innych białek.

4. Identyfikacja znanych białek wiążących się do badanego DNA. Badając oddziaływanie danego fragmentu

DNA z pełnym ekstraktem białkowym należy liczyć się z tym, że mogą się do niego wiązać poznane wcześniej

białka. Aby się o tym przekonać należy do reakcji dodać przeciwciała rozpoznające określone białko co

spowoduje opóźnienie migracji całego kompleksu (DNA/białko/przeciwciało) w stosunku do próby kontrolnej

(DNA/białko) (Rys.1, kieszonka 5).

5. EMSA umożliwia również monitorowanie obecności danego białka na kolejnych etapach jego oczyszczenia. W

tym przypadku na żel nakładane są różne frakcje białek po rozdziale chromatograficznym i kompleksacji z

badanym fragmentem DNA.

przeciwciało

kompetyt. specyf.

kompetyt. niespec

ekstrakt białkowy

DNA znakowany

Rys.1. Układ prążków testu EMSA w żelu poliakryloamidowym.

Footprinting

Technika ta stosowana jest w celu poznania, które nukleotydy danej sekwencji DNA, np. promotora, wiążą się bezpośrednio z

badanym białkiem. Wykonanie tego testu obejmuje następujące etapy:

1. Wyznakowanie jednego końca badanego fragmentu DNA, np. z wykorzystaniem kinazy polinukleotydowej.

2. Kompleksacja DNA z białkiem. Do tego celu można użyć zarówno oczyszczone białko, jak i ekstrakt w którym znajduje

się białko oddziałujące z badanym fragmentem DNA.

3. Trawienie. Preparat poddany zostaje hydrolizie z wykorzystaniem endonukleazy I. Warunki trawienia należy dobrać tak,

aby w wyniku reakcji uzyskać wszystkie warianty trawienia, tzn. wszystkie możliwe długości cząsteczek DNA od

znacznika do poszczególnych pozycji nukleotydowych. Ponieważ białko związane z DNA uniemożliwia trawienie

zajętego obszaru, nie dojdzie do powstania odcinków DNA o długościach odpowiadających odległości od znacznika do

pozycji związanych przez białko. Jako kontrolę należy przygotować trawienie znakowanego fragmentu DNA, który nie

był poddany kompleksacji z białkiem.

4. Rozdział elektroforetyczny. Preparaty po reakcji poddawane są denaturacji w celu uzyskania form jednoniciowych, a

następnie rozdziałowi w denaturującym żelu poliakryloamidowym. W żelu należy również rozdzielić preparat służący jako

marker mas cząsteczkowych, który pozwoli na określenie wielkości poszczególnych frakcji DNA. Po zakończeniu

rozdziału żel należy poddać ekspozycji na błonie radiologicznej w celu wizualizacji znakowanych fragmentów DNA. Te

fragmenty DNA, które powstały w wyniku trawienia preparatu a które nie zawierają na 5’końcu radioaktywnego

znacznika, nie będą widoczne na żelu.

5. Interpretacja wyniku. Znakowane cząsteczki DNA powinny być widoczne jako seria prążków rozdzielonych z

rozdzielczością do 1 nukleotydu. Obszar na w żelu, w którym brak jest prążków, odzwierciedla miejsce wiązania DNA z

białkiem. Wielkość frakcji odpowiadających odległości od znacznika do miejsca wiązania białka może zostać odczytana

po porównaniu do markera mas cząsteczkowych.

DNA kontrolny

50 pz

55 pz

DNA po kompleksacji

z białkiem

białko

fragmenty DNA

po trawieniu

55 z

50 z

Rys.2. Schemat wykonania testu foot printing .

Wykonanie testu EMSA

W eksperymencie badane będą trzy fragmenty DNA, Fr. I –84-35; Fr. II –34+16; Fr. III +17+66, reprezentujące różne

obszary badanego promotora. Numeracja arabska określa zakres sekwencji DNA w stosunku do miejsca startu transkrypcji,

czyli pierwszego nukleotydu ulegającego transkrypcji (+1). Fragmenty te poddawane będą reakcji z ekstraktem białkowym,

uzyskanym z tkanki w której dochodzi do ekspresji badanego genu. Każda reakcja prowadzona jest w trzech wariantach:

a. próba kontrolna - bez białek

b. reakcja z ekstraktem białkowym

c. reakcja z białkami i kompetytorem niespecyficznym, którym jest syntetyczny DNA - poli dIxdC.

Celem eksperymentu jest ustalenie, do którego fragmentu DNA wiąże się specyficzne białko.

Sprzęt i odczynniki

– Sprzęt do elektroforezy PAA

– składniki żelu PAA (Tab.1)

– katalizatory: TEMED i APS 10%

– buf. TGE

– EMSA buf.

– folia do suszenia

– nożyczki

– kaseta do ekspozycji RTG

– suszarka do żeli

– tipsy i eppendorfówki

Postępowanie

1. Szybki elektroforetyczne umyć wodą z detergentem i przetrzeć etanolem. Po wysuszeniu złożyć szyby wraz z

przekładkami.

2. Z roztworów wyjściowych pr zygotować 10 ml roztworu o podanym składzie.

roztwory wyjściowe

stężenia końcowy

akryloamid (39:1) 20%

bufor TGE 10X

0,5 X

Glicerol 40%

H 2 O do 10 ml

3. Część roztworu przeznaczyć na przygotowanie żelu uszczelniającego, tzw. „korka”. 1/10 roztworu, czyli 1 ml, przenieść

do probówki eppendorfa a następnie dodać do niej katalizatory reakcji polimeryzacji (2μl TEMEDu i 10 μl APS). Całość

wstrzyknąć za pomocą pipety automatycznej pomiędzy szybki elektroforetyczne tak, aby w dolnej części uformowała się

jednolita warstwa poliakryloamidu.

4. Po spolimeryzowaniu żelu uszczelniającego, do pozostałej części mieszaniny poliakryloamidu dodać 9 μl TEMED i 90μl

APS.

5. Mieszaninę wylać pomiędzy szybki i umieścić w górnej części grzebień dla uformowania się kieszonek.

6. Szyby ze spolimeryzowanym żelem umieścić w aparacie elektroforetycznym. Do aparatu nalać bufor elektoforetyczny

(0,5 X TGE).

7. Przygotować 9 mieszanin reakcyjnych dodając do probówek Eppendorfa następujące składniki:

Fragment DNA I (–84-35) II (–34+16) III (+17+66)

Nr próby 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1. H 2 O (μl) 2 2 - 2 2 - 2 2 -

2. bufor 2xst. (μl) 5 - - 5 - - 5 - -

3. polidIdC (μl) - - 2 - - 2 - - 2

4. białko (μl) - 5 5 - 5 5 - 5 5

5. DNA badany (μl) 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Poszczególne składniki należy dodawać, wg podanej kolejności. W podanym przykładzie nie dodajemy buforu reakcyjnego do

reakcji zawierającej białka, gdyż został on już dodany do mieszanin białkowych na etapie przygotowania ekstraktów. DNA

badany dodajemy dopiero po 5 minutowej inkubacji białek z kompetytorem. Uwaga: do reakcji podajemy znakowany

radioaktywnie DNA! Należy zachować ostrożność!

8. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez 10 min w temp. pokojowej.

9. Próby nałożyć do kieszonek żelu.

10. Elektroforezę prowadzić przy 100V do momentu, gdy barwnik osiągnie dolną część żelu.

11. Żel przenieść na bibułę, przykryć folią i przenieść do suszarki próżniowej ustawionej na temp +80 o C.

12. Wysuszony żel przenieść do kasety. W ciemni nałożyć na żel błonę rentgenowską z ekranem wzmacniającym.

13. Po zakończeniu ekspozycji trwającej ok. 18 godz. wywołać radiogram i wykonać analizę uzyskanych wyników.

– poli dIdC (1mg/ml)

– ekstrakty białkowe

– znakowany DNA

– ekran ochronny

– bibuła Watman 3MM

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: