Biotechnologia – ćwiczenia 2010/2011
Kolokwium 3. Magdalena Pawełkiewicz 18.01.2011 r.
Mapowanie i markery molekularne
Jak poznać strukturę genomu…?
· Genomy składają się z regionów kodujących i nie kodujących
· Regiony kodujące stanowią niewielki % całego genomu, są jak „wyspy” rozrzucone między sekwencjami nie podlegającymi transkrypcji. Dąży się do ustalenia:
- rozmieszczenia na chromosomach
- sekwencji w loci kodujących
- ich funkcji
- zmienności allelicznej
- wzajemnej interakcji
· Poprzez poznanie sekwencji całych genomów
- PROJEKTY SEKWENCJONOWANIA
Arabusopsis thaliana – rzodkiewnik – dwuliścienny gatunek
Oryza sativa – ryż – jednoliścienny gatunek
· Poprzez przyjęcie strategii badawczej
- PROJEKTY MAPOWANIA Z UŻYCIEM MARKERÓW MOLEKULARNYCH
Większość gatunków roślin
Mapy:
· Schematyczne odwzorowanie genomu organizmu lub elementu genetycznego (np. plazmidu) przedstawiające wzajemne położenie poszczególnych genów i innych elementów genetycznych.
Geny ułożone są liniowo na chromosomach – mapy liniowe
GENETYCZNE:
· Odległość genetyczna między genami (markerami) na chromosomie (grupa sprzężeń), wyrażana częstością zachodzenia rekombinacji mejotycznej między nimi
FIZYCZNE:
· Fizyczna odległość między markerami wyrażona w tysiącach lub w milionach par zasad
Co to jest mapa genetyczna?
· Mapy genetyczne wskazują na względne położenie specyficznych markerów wzdłuż chromosomu – informacja na temat struktury, funkcji i ewolucji genomu
· Spokrewnione gatunki zazwyczaj mają podobną zawartość i lokalizację genów i markerów
Markery:
· Potencjalnym markerem to jakakolwiek dziedziczna cecha fizyczna czy molekularna, różna pomiędzy osobnikami, łatwo wykrywalna
· Markerem może być gen lub odcinek nie kodujący jeżeli jego dziedziczenie można prześledzić
· Marker musi być polimorficzny co znaczy, że muszą istnieć alternatywne formy (allel) pomiędzy osobnikami w badanej populacji
· Im bliżej markery leżą obok siebie, mniejsze jest prawdopodobieństwo rozdzielenia alleli podczas rekombinacji = będą dziedziczyć się razem
· Odległość między dwoma punktami nie jest mierzona w jednostkach fizycznych ale w centymorganach
1 cM = 1% rekombniacji
· Im dalej od siebie są markery 1 i 2 – tym częstsze rekombinacje
Jednostka mapowa nie równa się 1 stałej odległości fizycznej ponieważ crossing over zachodzi z różną częstością w różnych rejonach w obrębie chromosomów
telomery – c/o zachodzi częściej
centromery – c/o zachodzi rzadziej
· Do raz stworzonej mapy dodajemy następne markery używając do analiz dokładnie tej samej populacji
· Takie mapy powstały dla wielu roślin, głównie użytkowych jak: ryż, kukurydza, soja….
Co to jest mapa fizyczna?
Mapa fizyczna mierzona jest w parach zasad (pz) i określa odległość między dwoma punktami.
Dwa markery mogą być genetycznie bardzo blisko siebie, np. mały współczynnik rekombinacji między nimi, ale daleko fizycznie – tysiące pz (zależy od gatunku)
Gatunek kpz/cM
- rzodkiewnik 139
- pomidor 510
- kukurydza 2140
Określ czy między markerami genetycznym odległość 1kpz (1.000pz) czy 1Mpz (1.000.000pz)
Koncepcje mapowania fizycznego:
· Określenie kolejności specyficznych sekwencji – markerów na chromosomach i ustalenie odległości między nimi w parach zasad
· Rekonstrukcja genomu przez uporządkowanie mniejszych fragmentów DNA w specjalnych wektorach
Populacja mapująca:
· Ma podstawowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu
· Formy rodzicielskie – to homozygotyczne linie wsobne, niski stopień pokrewieństwa, co zwiększy poziom polimorfizmu w potomstwie
· Populację mapującą stanowią rozszczepiające się potomstwo
· Liczebność
Markery – podział
Marker to cecha odróżniająca jednego osobnika od drugiego, cecha fenotypowa choroba dziedziczna, występowanie lub brak jakiegoś polipep. różnice w sekwencjach DNA
Markery genetyczne
· Markery morfologiczne, mutacje w genach z konsekwencjami w postaci zmian fenotypowych
- kształt liścia, barwa kwiatów, nasion, karłowatość, omszenie itp…
- mutacje, problemy z epistazą
- podlegają wpływom środowiska
- fenotyp przejściowy
- trudne do znalezienia sprzężeń
· Markery molekularne
o Markery białkowe: izozymy, allozymy
o Markery DNA
Restrykcja:
ü RFLP (+)
Restrykcja + PCR:
ü AFLP (+)
ü SAMPL
PCR:
ü RAPD (+)
ü SSR (+)
ü AP-PCR; DAF; SCAR; RAMP; AMP-FLP; SPAR; ISSR; SSCP
Dobry marker:
Ø Nieinwazyjna analiza (przeżyciowa)
Ø Powtarzalny
Ø Wykrywalny na wczesnych etapach rozwoju
Ø Losowo występujący w genomie
Ø Analiza zautomatyzowana
Ø Łatwa do śledzenia w potomstwie (cecha jakościowa, nie ilościowa)
Ø Wolna od wpływów środowiska – fenotyp przejściowy
Ø Monogeniczna (niemodyfikowana epistatycznie)
Ø Polimorficzna (zmienna w populacji)
- polimorfizm prosty – substytucja, delecja, insercja pojedynczych nukleotydów (zwykle dwa allele)
- polimorfizm złożony – zmiany na większą skalę (kilka do kilkunastu alleli)
???
· Z supernatantu musimy pozyskać DNA poprzez wytrącanie
· DNA wytrąca się w niskiej temperaturze w środowisku kwaśnym poprzez dodanie alkoholu
- alkohol etylowy – 2,5V supernatantu
- alkohol izopropylowy – 0,7-1V supernatantu
- wyizolowane DNA przemywamy etanolem (z resztek buforu, izopropanolu)
- osuszamy (etanol odparowuje)
- rozpuszczamy w buforze TE lub w wodzie:
4oC – przez noc – najlepiej
RT – do godziny
65oC – 10 min
Elektroforeza DNA
· Ilość DNA – przybliżeniu porównując intensywność prążków DNA w drabince
· Jakość – stopień degradacji:
- 1 wyraźny prążek
- SMIR ciągnący się za prążkiem świadczy o degradacji DNA
DNA dobrej jakości – jeden prążek
Marker wielkości – tzw. drabinka DNA
Zdegradowane SMIR to DNA pocięte przez enzymy, połamane; są to cząsteczki różnej długości migrujące w żelu
Definicje i zasady
Elektroforeza = ruch jonów i makromolekuł obdarzonych ładunkiem elektrycznym poprzez żel w wyniku przyłożonego napięcia.
Molekuły rozdzielane są ze względu na:
1. Wielkość
2. Strukturę
3. Rozkład ładunku
Czynniki wpływające na szybkość migracji DNA w żelu:
Ø Wielkość cząsteczki
Ø Konformacja DNA
Ø Koncentracja agarozy
Ø Wartość przyłożonego napięcia
Ø Skład nukleotydowy i temperatura
Ø Obecność barwników interkalacyjnych
Ø Skład buforu do elektroforezy (siła jonowa)
PCR – reakcja łańcuchowa polimerazy
Końce DNA nie są takie same: koniec 3` - OH- ; koniec 5` - PO3+
Nici dupleksu są przeciwstawne ale komplementarne. Nici DNA mogą denaturować i ponownie łączyć się (renaturacja).
Replikacja DNA in vivo wymaga wielu enzymów. Denaturacja nici; synteza starterów (fragmenty Okazaki); synteza nowego dupleksu DNA.
Synteza DNA in vitro wymaga jednego enzymu
· denaturacja DNA przez podgrzanie
· chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy DNA (primery, startery)
· dNTPs (wolne nukleotydy)
· synteza DNA odbywa się w kierunku 5` - 3`
· wymagany wolny koniec 3`-OH
· polimeraza Taq DNA – enzym
Polimeraz Taq
· nie jest niszczona w temperaturze 95oC
· stabilność termiczna
· optimum działania w temperaturze 72...
katarzyna.zajac211