AMINOKWASY, PEPTYDY I BIAŁKA
Aminokwasy
§ Wszystkie 20 aminokwasów budujących białka to a-aminokwasy, posiadające aminową i karboksylową grupę związaną z tym samym atomem węgla (a-węgiel)
§ Aminokwasy różnią się od siebie bocznymi łańcuchami (grupami R) decydującymi o ich budowie przes-trzennej, wielkości, ładunku elektrycz-nym i rozpuszczalności w wodzie
§ Każdy z 20 standardowych aminokwasów występujących w białkach ma przypisany trzyliterowy skrót i jednoliterowy kod ułatwiający opisywanie ich sekwencji w łańcuchach polipeptydowych
§ Kolejność atomów węgla w cząsteczce aminokwasu oznaczana jest przy pomocy dwu konwencji:
1. przy użyciu kolejnych liter greckiego alfabetu, poczynając od węgla a zwią-zanego z grupą aminową i karboksy-lową
2. przy użyciu kolejnych arabskich cyfr, rozpoczynając od węgla 1 podsta-wionego atomami o największych liczbach atomowych. Węglem 1 jest więc węgiel grupy karboksylowej
§ We wszystkich (oprócz glicyny) amino-kwasach a-węgiel jest podstawiony czterema różnymi podstawnikami (centrum chiralne). Chiralne aminokwasy występują w dwóch formach enancjomerycznych. Absolutna konfigu-racja podstawników asymetrycznego atomu węgla wyrażana jest w dwóch konwencjach:
3. R i S (patrz poprzedni wykład)
4. D i L. System ten został opracowany w 1891 przez Emila Fischera w oparciu o absolutną konfigurację aldehydu glicerynowego. Wszystkie związki chiralne posiadające konfigurację identyczną z aldehydem D-glicery-nowym (w projekcji perspektywicznej grupa CHO u góry, -OH po prawej) mają konfigurację D, związki chiralne o konfiguracji identycznej z aldehydem L-glicerynowym (w projekcji perspekty-wicznej grupa CHO u góry, -OH po lewej) mają konfigurację L. Stosowanie tego systemu do aminokwasów sprawia, że w projekcji perspekty-wicznej z grupą karboksylową u góry, D-aminokwasy mają grupę aminową po prawej, L-aminokwasy – po lewej
§ Do oznaczania własności skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego stosuje się konwencję l i d (l – dla związków skręcających płaszczyznę światła spolaryzowanego w lewo, d – w prawo). Kierunek skręcalności optycznej nie zawsze zgadza się z absolutną konfiguracją cząsteczki, nie wszystkie L-aminokwasy są lewoskrętne (l)
§ Wszystkie standardowe (występujące w białkach) aminokwasy są L-stereoizome-rami. D-aminokwasy występują w niektórych peptydach ściany komór-kowej bakterii i w niektórych antybioty-kach. Komórki syntetyzują określone enancjomery aminokwasów (a nie racematy) ze względu na asymetryczną budowę centrów aktywnych enzymów zaangażowanych w syntezę aminokwa-sów
Klasyfikacja aminokwasów
§ Ze względu na budowę R grup funkcyjnych wyróżniamy pięć klas aminokwasów:
1. Niepolarne, alifatyczne.
R grupy mają charakter niepolarny i hydrofobowy. Boczne łańcuchy alaniny, waliny, leucyny i izoleucyny mają tendencję do skupiania się razem w strukturze białka, stabilizując ją poprzez oddziaływania hydrofobowe. Glicyna, naj-prostszy aminokwas, jest formalnie niepolarna, ale jej bardzo mała R grupa praktycznie nie bierze udziału w hydrofobowych oddziaływaniach. Cechą charakterystyczną izoleucyny jest obecność dwóch węgli asymetrycznych. Metionina, jeden z dwóch zawierających siarkę aminokwasów ma niepolarną tioeterową grupę w łańcuchu bocznym
2. Aromatyczne.
Fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan posia-dające aromatyczne boczne łańcuchy są względnie apolarne (hydrofobowe), biorą więc udział w hydrofobowych oddzia-ływaniach. Hydroksylowa grupa tyrozyny może tworzyć wiązania wodorowe, jest ważną grupą funkcyjną wielu enzymów. Tyrozyna i tryptofan są bardziej polarne od fenyloalaniny ze względu na grupę hydroksylową tyrozyny i azot pierścienia indolowego tryptofanu. Tryptofan i tyrozyna, w mniejszym stopniu fenyloalanina, absorbują promieniowanie UV. Dlatego białka zawierające te aminokwasy wykazują charakterystyczne maksimum absorpcji przy długości fali 280 nm, co wykorzystuje się do identyfikacji białek i pomiaru ich stężenia w roztworze. Część światła przechodzącego przez roztwór przy określonej długości fali jest zgodnie z prawem Lamberta-Beera absorbowana proporcjonalnie do grubości warstwy absorbującej i stężenia absorbujących składników
= A
gdzie Io – intensywność padającego światła, I – intensywność transmitowa-nego światła, e - współczynnik ekstynkcji molarnej, c – stężenie absorbujących związków, l – długość drogi światła w absorbującej próbie
Wyrażenie A nazywa się absorbancją. Przy stałej grubości warstwy absorbującej (zwykle 1 cm) absorbancja A jest wprost proporcjonalna do stężenia absorbującej substancji. Molarny współczynnik ekstynkcji zależy od natury absorbującego związku, od rozpuszczalnika, długości fali świetlnej a także od pH, jeśli absorbujący związek jest w równowadze ze swoją zjonizowaną formą o innych właściwoś-ciach absorbancji
3. Polarne, obojętne.
Seryna, treonina, cysteina, prolina, asparagina i glutamina zawierają hydro-filne, zdolne do tworzenia wiązań wodorowych łańcuchy boczne. Polarność seryny i treoniny spowodowana jest ich grupami hydroksylowymi, cysteiny – grupą sulfhydrylową, asparaginy i glutaminy – obecnością grup amidowych. Treonina, podobnie jak izoleucyna, ma dwa węgle asymetryczne. Cykliczna struktura proliny jest umiarkowanie polarna. Iminowa grupa tego aminokwasu jest bardzo sztywna konformacyjnie, co redukuje strukturalną elastyczność regionów łańcucha polipeptydowego zawierającego prolinę. Cysteina łatwo ulega utlenieniu, tworząc kowalencyjnie powiązany mostkiem disiarczkowym dimeryczny aminokwas – cystynę. Cystyna jest silnie hydrofobowa. Mostki disiarczkowe odgrywają bardzo ważną rolę w budowie białek, wiążąc kowalencyjnie różne fragmenty tego samego lub innego łańcucha polipep-tydowego
4. Zasadowe
Zasadowe łańcuchy boczne lizyny, argininy i histydyny są bardzo hydrofilne. Lizyna ma w pozycji e dodatnio nałado-waną w pH 7 grupę aminową, arginina grupę guanidynową. Histydyna ma w okolicach pH obojętnego dodatnio naładowaną grupę imidazolową. W wielu reakcjach enzymatycznych reszta histydyny służy jako donor/akceptor protonu
5. Kwaśne
Kwas asparaginowy i glutaminowy w pH 7 mają ujemnie naładowane dodatkowe grupy karboksylowe
Niestandardowe aminokwasy.
Powstają przez modyfikację wbudowanych już w łańcuch polipeptydowy standardo-wych reszt aminokwasowych albo wystę-pują wyłącznie w stanie wolnym. Pochodną proliny występującą w białkach ścian ko-mórkowych roślin jest 4-hydroksyprolina. W kolagenie (białko tkanki łącznej) występuje 5-hydroksylizyna. W miozynie (białko kurczliwe mięśni) występuje 6-N-metylolizyna. W protrombinie (białko układu krzepnięcia krwi) i innych białkach wiążących Ca2+ występuje g-karboksy-glutaminian. Desmozyna, pochodna czterech reszt lizyny występuje w elastynie (białko tkanki łącznej). Bardzo rzadkim aminokwasem jest selenocysteina zawierająca selen zamiast siarki. W przeciwieństwie do innych niestandar-dowych aminokwasów jest ona wprowa-dzana do białka w trakcie translacji.
W komórkach występuje około 300 wolnych, innych niż standardowe aminokwasów. Należą do nich np. ornityna i cytrulina – kluczowe związki pośrednie syntezy argininy i cyklu mocznikowego
Aminokwasy jako kwasy i zasady
§ Po rozpuszczeniu w wodzie aminokwas staje się dipolarnym jonem obojnaczym mogącym działać jako kwas lub zasada. Substancje chemiczne o podwójnej naturze (amfotery) są amfolitami (amfo-terycznymi elektrolitami). Jednoaminowy i jednokarboksylowy aminokwas (np. alanina) jest dwuprotonowym kwasem, ponieważ grupa karboksylowa jak i aminowa mogą oddawać protony. Miareczkowanie aminokwasu zasadą lub kwasem powoduje stopniowe oddawanie/pobieranie protonów. Wykres miareczkowania ma spłaszczone fragmenty odpowiadające stopniowej deprotonacji grupy karboksylowej i aminowej. W niskim pH zjonizowana (uprotonowana) jest grupa aminowa, deprotonacji podlega grupa karbo-ksylowa. W środkowym punkcie pierwszego etapu miareczkowania (np. glicyny), w którym grupa karboksylowa traci proton, mamy równomolarne stężenie donora protonu +H3N-CH2-COOH i akceptora protonu +H3N-CH2-COO-. Punkt ten jest równy pKa grupy karboksylowej (pK=2.34). Krzywa mia-reczkowania przybiera następnie charak-ter prawie pionowy. W środkowym punk-cie tego fragmentu krzywej (dla glicyny jest to pH 5.97) mamy pełne usunięcie protonu z grupy karboksylowej. Wystę-puje tu wyłącznie dipol +H3N-CH2-COO-. W następnym etapie miareczkowania następuje usunięcie protonu z grupy aminowej. Równowagowy punkt tego etapu dla glicyny jest przy pH 9.6. Jest to pK grupy aminowej glicyny. Przy pH 12 następuje całkowita deprotonacja tej grupy. Glicyna występuje wtedy w formie jonu H3N-CH2-COO-.
§ pKa dla grupy karboksylowej glicyny (2.34) jest niższe od pKa dla typowej grupy karboksylowej kwasu organicz-nego (pKa=4.8). Wynika to z odpycha-jącego działania dodatnio naładowanej grupy NH3+ i ze stabilizującego działania powstającego jonu obojnaczego. pKa grupy aminowej glicyny jest niższe od pKa grupy aminowej metyloaminy z powodu odciągania elektronów przez elektroujemne atomy tlenu grupy karboksylowej. Analiza krzywej miarecz-kowania pokazuje, że glicyna ma dwa zakresy pH (ok. 2.34 i ok. 9.6) w których jest dobrym buforem
§ W pH 5.97 glicyna jest w pełni jonem obojnaczym, którego sumaryczny ładunek jest równy zeru. pH , w którym to następuje nosi nazwę punktu izo-elektrycznego (pI). Dla glicyny nie posiadającej zjonizowanych grup w łańcuchu bocznym punkt izoelektryczny jest średnią arytmetyczną dwóch pKa:
pI = ½(pK1 + pK2) = (2.34 + 9.60) = 5.97
Powyżej pI aminokwas ma ładunek netto ujemny i będzie się przemieszczał w polu elektrycznym w kierunku dodatniej elektrody (anody), poniżej pI aminokwas ma ładunek netto dodatni i będzie wędrował w kierunku ujemnej elektrody (katody)
§ Aminokwasy mające zjonizowaną grupę R mają bardziej skomplikowaną krzywą miareczkowania z trzema stanami jonizacji i trzema stałymi dysocjacji. Ich punkt izoelektryczny jest średnią pK dla grupy R (pKR) i pK dla grupy karboksylowej (w aminokwasach kwaś-nych) lub aminowej (w aminokwasach zasadowych)
Peptydy i białka
§ Aminokwasy wiążą się amidowym wiązaniem (wiązaniem peptydowym) między grupą karboksylową jednego a aminową drugiego aminokwasu. Tworzenie wiązania peptydowego jest reakcją kondensacji z wydzieleniem cząsteczki wody. W warunkach standardowych równowaga reakcji jest przesunięta w stronę reaktantów, do przesunięcia równowagi w stronę produktów konieczna jest aktywacja grupy karboksylowej
§ Krótkie (2-12 reszt) polimery reszt amino-kwasowych noszą nazwę peptydów, dłuższe (13-20 reszt) – oligopeptydów, jeszcze dłuższe to polipeptydy
§ W każdym peptydzie wolna grupa a-ami-nowa tworzy N-koniec, wolna grupa a-karboksylowa tworzy C-koniec. Podlega-ją one jonizacji (stałe jonizacji są nieco inne niż w wolnych aminokwasach) ra-zem z innymi grupami funkcyjnymi podstawnika R. Suma ładunków zjonizo-wanych grup decyduje o punkcie izo-elektrycznym łańcucha polipeptydowego
§ Hydroliza wiązania peptydowego jest zasadniczo reakcją termodynamicznie faworyzowaną, jednak jej wysoka energia aktywacji sprawia, że wiązania peptydowe są bardzo stabilne (t1/2 wynosi w warunkach wewnątrzkomórkowych średnio około 7 lat)
§ Biologicznie aktywne peptydy i poli-peptydy wykazują aktywność biologiczną w niskich stężeniach. Należą do nich m.in. oksytocyna (9 reszt aminokwa-sowych) stymulująca skurcze macicy, bradykinina (9 reszt) hamująca stany zapalne, czynnik zwalniający tyreotropinę (3 reszty). Do krótkich peptydów mależy szereg antybiotyków i niektóre toksyny (np. amanityna). Nieco dłuższe peptydy o aktywności biologicznej to insulina (dwa łańcuchy polipeptydowe liczące 21 i 30 reszt aminokwasowych, połączone mostkiem disiarczkowym), glukagon (29 reszt), kortykotropina (39 reszt)
§ Białkami nazywa się zwyczajowo polipeptydy zawierające więcej niż 100 reszt aminokwasowych. Białka zbudowane z jednego łańcucha polipeptydowego to białka monome-ryczne, zawierające conajmniej dwa łańcuchy to białka multimeryczne (oligomeryczne). Multimery zbudowane z identycznych łańcuchów polipeptydo-wych (protomerów) to białka homo-multimeryczne, białka zbudowane z różnego typu łańcuchów polipepty-dowych to heteromultimery. Jeśli protomery nie są powiązane kowalen-cyjnie to noszą nazwę podjednostek
§ Możemy wyliczyć przybliżoną ilość reszt aminokwasowych w białku dzieląc masę cząsteczkową białka przez średnią masę cząsteczkową standardowego aminokwa-su równą 110 (z uwzględnieniem masy czasteczki wody usuwanej w czasie tworzenia wiązania peptydowego: 128-18 =110)
§ Białka złożone zawierają oprócz łańcucha polipeptydowego dodatkową niebiałkową grupę prostetyczną. Ze względu na chemiczny charakter grupy prostetycznej dzielimy białka złożone na:
1. glikoproteiny – zawierające skład-nik cukrowy. Około 75% białek jest glikozylowane. Wiele z nich to białka zewnątrzkomórkowe lub białka błonowe z glikozylowaną domeną zewnątrzkomórkową
2. lipoproteiny – zawierają część lipidową, zaangażowane są między innymi w transport lipidów
3. nukleoproteiny zawierające kwasy nukleinowe, zaangażowane w przechowywanie i przekazywanie informacji genetycznej
4. fosfoproteiny – z grupami fosforanowymi zestryfikowanymi z resztami hydroksylowymi seryny, treoniny i tyrozyny
5. metaloproteiny zawierające sche-latowany kation metalu
6. hemoproteiny zawierające hem jako grupę prostetyczną. Należą równocześnie do metaloprotein ze względu na obecność metalu w hemie
7. flawoproteiny zawierające flawino-we nukleotydy jako grupę prostetyczną
Struktura białek
§ Strukturę białek rozpatrujemy na kilku poziomach organizacji:
1. struktura pierwszorzędowa – sekwencja aminokwasów w łańcuchu polipeptydo-wym
2. struktura drugorzędowa – przestrzenna organizacja łańcucha polipeptydowego (a-helisa, b-kartka)
3. struktura trzeciorzędowa – przes-trzenna organizacja struktury drugorzę-dowej
4. struktura czwartorzędowa – występuje tylko w białkach zawierających podjednostki, - wzajemna organizacja przestrzenna tych podjednostek
Preparatyka i analityka białek
§ Pierwszym etapem preparacji i oczyszczania białek jest rozbicie tkanek i komórek – otrzymanie tzw. surowego ekstraktu. Jeśli konieczne jest otrzymanie subfrakcji komórkowych stosuje się różnicowe wirowanie (patrz wcześniejszy wykład)
§ Następny etap polega na zmniejszeniu objętości preparacji przez wytrącanie białka z roztworu przy zastosowaniu różnicy pH, wysokiej siły jonowej, rozpuszczalników organicznych
§ Wytrącone białka rozpuszcza się ponownie w mniejszej objętości. Stosuje się na tym etapie również dializę – zmianę niskocząsteczkowej części składu roztworu białkowego umieszczo-nego w przestrzeni ograniczonej błoną półprzepuszczalną odgraniczającą białko od dużej objętości roztworu, którego składniki biorą udział w wymianie. W wyniku dializy następuje ustalenie równowagi między składnikami na zewnątrz błony a składnikami wewnątrz błony
§ Następnym etapem jest frakcjonowanie preparatu technikami chromatografii kolumnowej. Istnieje szereg typów chromatografii opartych na różnicach m. in. w ładunku, wielkości, powinowactwie do fazy stacjonarnej między rozdzielanymi białkami. Chromatografia jonowymienna polega na wiązaniu się zjonizowanych cząsteczek białka do fazy stałej wypełniającej kolumnę i posiadającej ładunek przeciwny do wiązanych białek. Zmiana ładunku białka poprzez zmianę pH lub zmiana oddziaływań między związanym białkiem a fazą stałą w wyniku zmiany siły jonowej powoduje stopniowe zwalnianie białek, poczynając od najsłabiej wiązanych. Filtracja żelowa polega na zróżnicowaniu elucji białek z kolumny na skutek wnikania mniejszych białek w strukturę usieciowanych ziaren wypełniających kolumnę. W chromatografii powinowac-twa białka wiążą się specyficznie z odpowiednimi związkami (ligandami) na zasadzie oddziaływań typu enzym – inhibitor, przeciwciało – antygen, receptor – przekaźnik sygnału. Elucja wolnym ligandem zwalnia białka związane uprzednio z kolumną.
§ Zwiększenie długości kolumny zwykle polepsza frakcjonowanie. Jednak przy długich kolumnach zmniejsza się szybkość elucji, co powoduje dyfuzję i zmniejszenie precyzji rozdziału. Zjawisko to wyeliminowane jest przy zastosowaniu HPLC – wysokosprawnej chromatografii cieczowej, w której zastosowano operujące pod wysokim ciśnieniem pompy oraz odporne na ciśnienie materiały chromatograficzne
§ Oczekiwanym rezultatem końcowym jest uzyskanie homogennnego preparatu określonego białka
§ Homogenność preparatu określa się powszechnie technikami elektroforetycz-nymi. Białka umieszczone w polu elektrycznym będą wędrować do elektrody o przeciwnym ładunku niż posiadany przez białko. Przy zasto-sowaniu usieciowanego polimeru jako nośnika (żel poliakryloamidowy) ruchliwość poszczególnych białek zależeć będzie od stosu...
pajro