Ćwiczenie 2
Temat:
Pozyskiwanie mikroorganizmów zdolnych do biodegradacji związków ksenobiotycznych - identyfikacja szczepów bakteryjnych zdolnych do rozkładu katecholu oraz fenolu (cz. 2)
Zagadnienia teoretyczne:
q budowa ściany komórkowej bakterii gramdodatnich oraz gramujemnych, barwienie Grama
q węglowodory aromatyczne pochodzenia antropogenicznego i ich wpływ na organizmy żywe
q drogi rozszczepienia pierścienia aromatycznego (rozszczepienie typu orto i meta)
Część praktyczna:
Materiały:
Ø szkiełka podstawowe
Ø odczynniki do barwienia Grama
Ø sól fizjologiczna, eza
Ø denaturat
Ø testy API 20NE - pokazowe
Ø przygotowane, posiane skosy do założenia hodowli
Ø kolby z płynną pożywką Kojima
Ø sterylne pipety 5 ml
Ø pipety automatyczne, końcówki
Ø 0,25 M roztwór fenolu
Ø 0,5 M roztwór katecholu
Procedura:
IDENTYFIKACJA SZCZEPÓW BAKTERYJNYCH:
q z uzyskanych hodowli płytkowych (cz.1) wybrać pojedyncze kolonie bakterii i oczyścić metodą posiewu redukującego na płytkach z zestalonym bulionem agarowym oraz przesiać na skos agarowy. Inkubować 48 godzin.
q Ze skosu oraz z płytki posianej redukcyjnie pobrać niewielką ilość materiału i wykonać rozmaz, na podstawie barwienia metodą Grama zaklasyfikować wyizolowane bakterie do grupy bakterii gramujemnych lub gramdodatnich.
ODCZYT PRZYGOTOWANYCH TESTÓW API 20 NE:
q przeprowadzono charakterystykę biochemiczną i fizjologiczną wybranych szczepów G(-), wyizolowanych z prób środowiskowych, w oparciu o test kodowy API 20 NE firmy BioMerieux Marcy I’Etoile (Francja), który służy do oznaczania pałeczek gramujemnych, nie należących do rodziny Enterobacteriaceae. Test wykonano zgodnie z instrukcjami i w oparciu o odczynniki, podane przez producenta
q po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 30oC należy odczytać wynik w postaci siedmiocyfrowego kodu, odpowiadającemu poszczególnym rodzajom i gatunkom bakterii, opisanym w katalogu API 20 NE.
ZAŁOŻENIE HODOWLI:
q bakterie wyrosłe na skosach agarowych w sterylnych warunkach spłukać do kolby zawierającej pożywkę Kojima.
q oznaczyć spektrofotometrycznie gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przy długości fali 600 nm wobec próby ślepej (wody destylowanej).
q do każdej kolby dodać odpowiednio taką objętość 0,25 M roztworu fenolu lub 0,5 M katecholu aby stężenie substratu w kolbie wynosiło 5 mM (objętość podłoża wynosi 100 ml).
q hodowlę prowadzić przez tydzień.
LITERATURA ŹRÓDŁOWA:
peroni69